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【冯仁丰】介绍2020年的ISO 17511文件第二版(17)

2021-4-22 16:27| 编辑: 归去来兮| 查看: 1674| 评论: 0|来源: 冯仁丰

摘要: 在第5.4章中,叙述了以特定校准品校准的参考检测程序(RMP),定义被测量的情况。5.4 以特定一级校准品校准的RMP定义被测量的情况5.4.1 通用考虑在介绍以特定一级校准品校准的RMP定义被测量的溯源情况前,为了让大家 ...


在第5.4章中,叙述了以特定校准品校准的参考检测程序(RMP),定义被测量的情况。


5.4 以特定一级校准品校准的RMP定义被测量的情况

5.4.1 通用考虑


在介绍以特定一级校准品校准的RMP定义被测量的溯源情况前,为了让大家有更多的理解和考虑,结合这个情况中,介绍的两个示例,我先说一些我对这两个分析物的了解。


先说的是糖化血红蛋白。


为了糖尿病的诊断和控制,医学中对糖尿病病人要求进行糖化血红蛋白的检测。但是很长时间以来,各个不同方法间的检测结果很不一致。尽管美国于1983年开展了9年的糖尿病控制与并发症研究(DCCT)。依据DCCT结果,NIH、美国糖尿病学会(American Diabetes Association,ADA)和其他专家组建议:对所有糖尿病病人治疗时,应该使血糖水平控制到正常水平,以减少并发症。也是第一次依据DCCT GHB值,确定了科学的血糖目标。例如,ADA 推荐所有糖尿病病人必须将GHB控制在7%以下(非糖尿病的参考范围为4%~6%);超过8%的病人应该考虑需要“有进一步的措施”。但是,当时美国DCCT使用了强制性的离子交换层析方法,并且全部以Bio-Rad的产品为准,才得到了可比较的糖化血红蛋白检测结果。可是这个方法没有可用的校准品。很难在国际上推广应用。


为了克服这个标准化差的问题,IFCC建立了工作组,以确定国际标准化。工作组决定发展一个参考系统,使常规方法可以溯源。参考系统的主要组成是参考方法,它能特异地检测HbA1C,是对参考物质定值的必须手段。首先,IFCC糖化血红蛋白标准化工作组,经过详细研究,确定了标准化的分析物定义:决定未来检测方法被要求可特异地检测血红蛋白β-链糖化N-端缬氨酸被葡萄糖糖化的那个残基。将这个被测量定义为HbA1c。


对分析物的定义:IFCC工作组定义HbA1c为:血红蛋白在b链的一个或两个N-端缬氨酸被不可逆地糖化。这没有排除在a或b链的其他处被糖化的血红蛋白。在血红蛋白b-链的N-端缬氨酸,未被葡萄糖糖化的血红蛋白命名为HbA0。

 

目标明确了,开始从检测方法学上考虑,要建立该标准化方法的参考物质。确定了IFCC糖化血红蛋白的一级参考物质为:


一级参考物质:以纯HbA1c和纯HbA0配制的混合物,用于参考方法的校准。这些组分用离子交换与亲和层析予以分离,以毛细管等电聚焦电泳、与电雾离子化质谱分析确定特性。

 

  在形成标准化的研究中,确定了参考方法。最后确定的两个参考方法,真正检测的是糖化血红蛋白或未被糖化的血红蛋白,在血红蛋白b-链N-端,从缬氨酸起的六个氨基酸的一段多肽。因此IFCC参考方法检测的是这段六肽,一个是被糖化的六肽,一个是未被糖化的六肽。


参考方法:建立了两个参考方法,可特异地检测b链糖化的N-端残基。原理是:首先用蛋白水解酶裂解血红蛋白为多肽,然后用HPLC一级质谱或毛细管电泳检测b-链的特异的糖化和非糖化的N-端多肽。


上述内容,对照ISO 17511的第二版文件中第5.4章中叙述的通用考虑,可以较容易地理解第5.4.1节内说的意思。


5.4 以特定一级校准品校准的RMP定义被测量的情况

5.4.1 通用考虑


以某个特定一级校准品校准RMP定义的被测量的校准等级(具有溯源性到SI),被描述在图3。在这样的情况下,该RMP检测的量,是被测量的一个成分(如,一个多肽片段或一个决定簇),不是预期被检测的该量的完整分子结构。在5.4.2至5.4.10中详尽地阐述了这些类型的校准等级的描述中要解决的特征。


上面:……该RMP检测的量,是被测量的一个成分(如,一个多肽片段或一个决定簇),不是预期被检测的该量的完整分子结构。这里,糖化血红蛋白是整个被测量,但是在实际检测中,IFCC检测方法仅仅是检测了方法中从β链的N-端起的六个氨基酸多肽。在参考方法检测中,首先对样品中的β链血红蛋白,从血红蛋白β链的N-端起,在第6和第7个谷氨酸间被胞内蛋白酶切开,使N-端形成了一个六肽的多肽。见下图。



上图左侧是未被糖化的血红蛋白β链的N-端被酶切下的HbA0六肽;右侧为被糖化的血红蛋白β链的N-端被酶切下的HbA1c六肽。


这两个六肽是IFCC参考方法实际检测的被测量。不是预期被检测的血红蛋白该量的完整分子结构。


而IFCC参考物质,是以纯化的HbA1c和HbA0按照比例混合配制形成的。在检测中,必须按照IFCC检测程序,首先被酶在离开β链的N-端起,以后的第6和第7个谷氨酸间被胞内蛋白酶切开,使N-端形成了一个六肽的多肽。然后,去校准IFCC的参考方法。


因为这样,在第5.4 章中,的第5.4.1节叙述了以上这些话。


我接着将显示的图3中的每一个方块内容,逐一介绍。


图3—校准等级—以某个特定

一级校准品校准了某个RMP定义的被测量


在图右侧的最高那个方块,为p.1;该方框内容:为评估纯度或证实纯物质的适合目的的检测程序,如,qNMR、质量平衡、基因序列。在制备IFCC参考物质的文献中,叙述了这样一段话:首先,分离纯化的β-N-端糖化血红蛋白A和非糖化的血红蛋白,纯化到均一。使用的技术为阳离子交换和亲和层析去纯化,以及高效液相层析、毛细管等离子聚焦、电喷雾电离质谱(electrospray ionisation mass spectrometry)、和多肽图谱(peptide mapping),去确定特性。这些检测方法不需要任何校准,为了了解纯化的情况,进行样品的检测。结果确定了,从健康人、非糖尿病自愿者全血得到血红蛋白,为非糖化血红蛋白A,纯度达>99.5%;和β-N-端糖化血红蛋白A,纯度>98.5%。但是,多肽图谱显示的结果,在β-N-端糖化血红蛋白A内依然含有一些非-β-N-端糖化血红蛋白A,与β-N-端糖化血红蛋白A共同洗脱。在这些制品中实际β-N-端糖化血红蛋白A含量,可以用标准添加方法、酶切的程序予以确定,定量β-N-端多肽在95%~97.5%的范围。


因此,我个人认为,文献中上述内容所涉及的检测纯化的HbA1c与HbA0中的各种方法,都是在p.1中指的:为评估纯度或证实纯物质的适合目的的检测程序。经过p.1的确认,使纯化的HbA1c和HbAo成为IFCC糖化血红蛋白参考方法的一级参考物质m.1。


5.4.2 被测量定义


某个特定决定簇的选择性或是被测量分子结构的一部分,以特定一级校准品校准的(见图3,m.2)一个较高等级RMP(见图3,p.3)应定义该被测量。


文件中再次对什么是糖化血红蛋白的IFCC定义进行了下列叙述:


示例:在IFCC的血红蛋白A1c(HbA1c)参考检测系统中,被测量被定义为全血中血红蛋白A1的β链上,在缬氨酸N-端或ε-氨基酸端被糖化(HbA1c)残基,相对于β链血红蛋白A非糖化组分(HbA0)的摩尔比率。无论是否糖化在一个或二者N-端的缬氨酸和β链的ε氨基酸上的血红蛋白(Hb),被定义为糖化血红蛋白分析物。


需要大家注意的是,第一次看到,对什么是IFCC定义的糖化血红蛋白中,除了以往叙述之外,又多出了对缬氨酸N-端或ε-氨基酸端被糖化的内容,究竟怎么理解,我还需要学习。

 

从图左侧的m.1起,通过与上图中右侧p.2结合,我理解为对两个纯化的HbA1c和HbA0参考物质,进行称量的过程。配制出图左侧的m.2。这是按照IFCC参考方法要求,将纯HbA1c和HbA0按照不同比例。配制出6个校准液,成为该溯源系列中的参考物质m.2。由于前述的各个程序和方法,已经确认了m.2内含的HbA1c和HbA0的准确量。上述这些内容,在ISO 17511第二版的第5.4章中,在第5.4.3和第5.4.4节中叙述。


5.4.3 一级RM值的设定


一级RM(见图3,m.1)应是被一个或多个MP(为确认纯物质纯度的证实和确定)设定的值(见图3,p.1)。被选择的MP应是具有的性能特性的方法,有助于确保为一级RM设定值最小的相对可达到的标准检测不确定度(在图3中以缩略%ruref表示)。


5.4.4 一级校准品值的设定


一级校准品(见图3,m.2)应被一个或多个一级RMP(如,称量法)设定值(见图3,p.2)。选择一级RM(见图3,m.1),除了一级校准品的制备和值的设定(见图3,m.2)外,还与RMP结合(见图3,p.3),对二级参考物质定值。这些二级参考物质,大多即为人的系列新鲜全血。这些被IFCC的HbA1c标准化工作组参考实验室确定了HbA1c的参考值后,成为m.3校准品。IFCC参考实验室将具有HbA1c可靠的结果的m.3传递给各个厂商。

 

示例1:在IFCC的血红蛋白A1c(HbA1c)的参考检测系统中,对一级校准品(见图3,m.2)设定值,用于RMP的校准(见图3,p.3),将纯HbA1c和纯HbA0混合;这两个分别使用阳离子交换和亲和层析分离,使用毛细管等电聚焦和电喷雾离子化质谱确定[48]


5.4.5 在校准等级中RMP的选择和预期用途


RMP(见图3,p.3)(以一级校准品(见图3,m.2)校准时,定义了被测量)应被用于设定具有复杂基质的二级校准品或二级RM(见图3,m.3)。二级校准品或二级RM(见图3,m.3)应与人样品在二者初始MP(见图3,p.3)用于设定它的值,以及以后MP(见图3,p.4)为厂商工作校准品(见图3,m.4)设定值。


示例:在IFCC的血红蛋白A1c(HbA1c)的参考检测程序中,有两个可用的RMP(见图3,p.3),选择地检测血红蛋白(Hb)β链糖化的N-端残基。Hb被蛋白水解酶切为多肽。特定糖化的和非糖化的Hb β链的N-端多肽,被HPLC分离、接着被或是质谱或是毛细管电泳检测[49][50]


从第5.4.6节起,厂商得到了由IFCC参考实验室确定全血内糖化血红蛋白(HbA1c)含量的人新鲜全血,接着在厂商内部,以这些具有IFCC定义的HbA1c值的全血,作为厂商最高等级的参考物质。在厂商内部,与厂商选定的检测程序(MP)一起,形成一个检测系统,对厂商的工作校准品进行定值。这些工作校准品与人的新鲜样品是可以互换的。这些内容可见以下在第二版ISO 17511中第5.4.6与5.4.7节的叙述。


5.4.6 厂商选定MP


厂商选定MP(见图3,p.4)应确定一个检测系统,被一个或多个二级校准品或二级RM校准(见图3,m.3)。它的主要目的是转换正确度到厂商工作校准品(见图3,m.4)。因为这样,这个MP应被选定,部分因校准品(见图3,m.3和m.4)与人样品是可互换的。


注:这样的二级RM或二级校准品应通常具有类似预期被终端用户IVD MD检测的人样品的基质,改善这些RM将与人样品是可互换的可能性,有助于确保它们与MP被预期去校准(即,[图3,p.4和/或p.5]。)一起使用的适用性。


5.4.7 厂商工作校准品


厂商工作校准品(见图3,m.4)应按照厂商选定MP(见图3,p.4)设定了它的值。校准物质(见图3,m.4)应与预期的人样品展现可互换性。有助于确保与厂商选定MP(见图3,p.4)一起使用的合适性,和被校准的程序,即厂商常设MP(见图3,p.5)。

 

注:厂商的工作校准品经常是有基质的物质,类似被用于终端用户IVD MD检测的人样品,如一组人样品或系列混合人样品。

 

然后,厂商以工作组校准品为准,对厂商的常设检测程序(MP)进行校准,对厂商的终端用户校准品进行定值。


这个终端用户校准品再与厂商的终端用户检测系统结合(即终端用户IVD MD),形成可以提供让临床实验室用于对临床样品进行糖化血红蛋白的检测。这样使临床样品的HbA1c的检测结果,在可靠性上,它的量值可以上溯到IFCC参考方法与参考物质,实现了溯源性。


ISO 第二版17511的第5.4.8、5.4.9、5.4.10节内容参见以下。


5.4.8 厂商常设MP


厂商常设MP(见图3,p.5)应确定被一个或多个厂商工作校准品校准的MP(见图3,m.4)或较高类型的校准品,并被确认了分析选择性。


5.4.9 终端用户IVD MD校准品


厂商终端用户IVD MD校准品(见图3,m.5)应按照厂商常设MP(见图3,p.5)设定了它的值,并被预期去校准终端用户IVD MD。终端用户IVD MD校准品(见图3,m.5)设定值的ucal,应由厂商(见4.7)估计,合并所有相应较高等级的不确定度,除了在校准等级中以后MP的每一个的不确定度外,下到和包括厂商常设MP 图3,[p.5]。


5.4.10 终端用户IVD MD


终端用户IVD MD(图3,p.6)应描述一个被一个或多个终端用户校准品校准的检测系统。这个MP,在确定的被测量校准等级中最后的MP,被用于检测人样品,和产生被测量的最后检测值,具有被终端用户估计的报告值的合并标准检测不确定度,考虑在确定的校准等级的每个较高步骤累积的所有已知的检测不确定度。

 

说到这里,IFCC的HbA1c的溯源内容,应该是完成了。


可是,我想还要说明的是:


1、为什么IFCC参考方法使用的胞内蛋白酶对糖化的和未糖化的血红蛋白,就切在从β链N-端起的第六个氨基酸?当然,在也可能因为使用的这个酶,它就切在第六和第七个氨基酸的肽链,这是它的酶的专一性。但是,今天的生物化学,你完全可以选择另一个胞内蛋白酶,切在其他位置的肽链。为什么IFCC参考方法就选择这个切法?有什么含义吗?很有道理的!因为在所有的糖化血红蛋白中,HbS是血红蛋白的遗传变异体。它在β链N-端起的第六个氨基酸,不是谷氨酸,是缬氨酸。在使用IFCC参考方法开始,使用了专门在两个谷氨酸间肽链的切开,因此HbS不会被误认为是HbA1c的结构。这是非常特异的表现。如下图所示。



但是,当厂商拿到了具有IFCC参考实验室确定HbA1c的人全血样品,厂商内部开始建立自己的校准品值时,面临实验室的常规条件,无法做到如IFCC的参考方法的定义。第一,什么是非糖化血红蛋白?IFCC是以β链N-端的缬氨酸未被糖化的那个血红蛋白为非糖化血红蛋白。这是在IFCC参考实验室可以做到的。常规实验室无法实现。按照对每个被检测的分析物定义上,IFCC的糖化血红蛋白在根本上否认了原先以血红蛋白的中心,那个铁原子定义血红蛋白的做法。但是在临床实验室的常规工作,至今所有确定血红蛋白的方法都是比色法。即以三价铁离子具有红色为依据。从根本上检测的做法与IFCC绝然不同。因此,原先IFCC参考方法对糖化血红蛋白的定义上,以链N-端的缬氨酸被糖化的血红蛋白,除以链N-端的缬氨酸未被糖化的血红蛋白,加上在β链N-端的缬氨酸被糖化的血红蛋白之和,确定该样品内糖化血红蛋白比率。但是现在还是以含有总的三价铁离子的所有血红蛋白为分母,分子倒是可以做到如IFCC的参考方法那样,为β链N-端的缬氨酸被糖化的血红蛋白。如罗氏开发的免疫比浊方法。但是,现在分母偏大了,使得到的最后糖化血红蛋白结果偏低。为此,罗氏公司使用了一个仅仅抗β链N-端的缬氨酸起的4个氨基酸的抗体,去检测血液内的糖化血红蛋白。这样,将很多非IFCC定义的那些异构体血红蛋白包含了进来,如上述的那个HbS。这是有意地放大了分子的值,使最后的HbA1c以比率值,在数量量值上与IFCC值非常接近。这些内容在罗氏的“HbA1c和因血红蛋白疾病的干扰”小册子上,讲得非常清楚。目的是一个,如何使罗氏的HbA1c检测结果在数量量值上,与IFCC具有溯源性!


这些内容告诉大家,不要以为具有溯源性的常规方法,在检测原理上与IFCC的参考方法一致!它只是在检测结果的量值上可以溯源到IFCC!


2、另外,IFCC的HbA1c从设计和具体检测上都非常完美。但不是说,与IFCC的HbA1c检测系统具有溯源性,就可以证明,该公司的检测方法也是完美的。这是很错误的。目前,我在ISO 17511的第二版上,看到对HbA1c的定义,似乎有不同。是否IFCC正在考虑有些修改?所有一切,尚需学习。


以上我的认识看法,期望大家批评指正。


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