免疫学诊断试剂研发—常见示踪物及标记方法

标记免疫测定方法主要由抗原抗体特异结合反应和标记物示踪检测两部分组成。标记物是高灵敏免疫测定的物质基础，通常采用各种化学交联试剂将其与特异性抗原/抗体共价交联，从而得到标记物-抗原/抗体结合物，是标记免疫测定试剂的核心组分。常用标记物可分为放射性核素和非放射性核素，后者包括荧光物质、酶、化学发光剂、胶体金、生物素和量子点等。

酶

作为生物催化剂，是免疫检测中最常见的示踪物，是整个免疫分析体系中催化底物、提供可检测信号的组分，对整个免疫检测的灵敏度、稳定性和可操作性起重要的作用。

   1.辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）

HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量为44kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合物。是目前在ELISA中应用最为广泛的标记酶，主要是因为其一方面易于提取，价格相对低廉；另一方面性质稳定，易于保存，与抗原或抗体偶联后活性很少受影响。

   2.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP/ALP）

AP是一种磷酸酯水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜中提取，但两种来源的AP理化性质存在差异：菌源性AP分子量为80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜来源AP分子量为100kD，最适pH为9. 6；肠黏膜来源AP的活性高于菌源性AP。在酶免疫技术中应用AP系统，其灵敏度一般高于HRP系统,空白值也较低,但由于AP较难获得高纯度制剂，稳定性较HRP差,价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，故其应用不如HRP普遍。

   3.β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）

β-Gal是一种来源于大肠杆菌的四聚体蛋白，分子量约为540kD，最适pH为6.0~8.0。由于人类血液标本中缺乏此酶，以其制备的酶标记物在测定时不易受到内源性酶的干扰，特异性较强，故常用于均相酶免疫测定中。

1.戊二醛交联法  

是将酶分子表面的多糖羟基氧化为活泼的醛基，醛基与抗体的氨基形成Schiff碱，再经硼氢化钠等还原而结合，此法常用于辣根过氧化物酶的标记。 

异型双功能交联剂也可用于酶标记物的制备，常用的有SPDP与SMCC。SPDP上的氨基与一个蛋白质分子反应，向该蛋白质中引入吡啶二硫基，吡啶二硫基由DTT还原形成硫醇基。硫醇基再与另一蛋白质分子形成二硫键，从而形成异二聚物蛋白质。SMCC先与酶上的氨基反应，引入马来酰亚胺基团，而要交联的另一个蛋白通过2-巯基乙胺等试剂引入巯基，马来酰亚胺基团再与巯基反应，形成酶标记物。    

荧光素与荧光蛋白

荧光是由荧光物质吸收外界能量发生电子跃迁然后以光量子形式释放出能量而形成。

常见荧光素与荧光蛋白

1.异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）

2.四乙基罗丹明（rhodamine B200，RB200）

B200, RB200与FITC的绿色荧光形成鲜明的对比,常用于双重标记或对比染色，但其缺点是RB200荧光效率较低。

3.四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC） 

4.藻红蛋白（phycoerythrin，PE）

1.搅拌法   

优点是标记时间短，荧光素用量少。缺点是影响因素多，非特异性荧光染色较强。

2.透析法   

发光物质

常见发光物质的标记方法

生物素/亲和素

生物素广泛分布在动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kDa，又称维生素H或维生素B7。

生物素标记

1.活化生物素 

2.生物素标记蛋白质 

纳米颗粒

1.胶体金

2.胶体硒  

3.乳胶微球  

（1）聚苯乙烯微球

（2）荧光微球

（3）磁性微球

（4）量子点

1.胶体金标记   

胶体金颗粒表面带有负电荷，与蛋白氨基酸所带阳性电荷依靠静电力互相吸引。

2.胶体硒标记   

胶体硒标记蛋白的原理是将pH值调整至等于或偏碱于蛋白的等电点，易吸附于胶体硒颗粒的表面标记。

3.乳胶颗粒标记   

乳胶微球可通过物理吸附进行标记，或对微球表面的羧基或氨基进行活化，与蛋白进行共价偶联标记。

4.量子点标记      

纳米颗粒与抗原、抗体等生物分子偶联的方法主要有静电吸附法、生物素-亲合素法、共价结合法。