宏基因组二代测序技术在临床病原学诊断中的应用

mNGS能全覆盖检测细菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次体、真菌、病毒和寄生虫等所有病原体。与传统方法比较，mNGS在病原体检测方面有如下优势。

1.1 检测新发未知病原体

近年来，不同病毒间的交叉重组、重配所导至的新发传染病暴发越来越频繁。传统PCR检测技术的瓶颈是需要根据已知病原体序列信息预先设计引物，而mNGS能够对临床样本中的所有核酸序列进行无偏倚测序，能快速鉴定新发病原体。如2019年12月15日在中国武汉出现不明原因肺炎患者，就是使用mNGS迅速在患者肺泡灌洗液标本中检出冠状病毒，并完成全基因组测序。据此，世界卫生组织(World Health Organization,WHO)于2020年1月12日命名该病毒为新型冠状病毒(2019-nCoV)。由此可见，mNGS在2019-nCoV的发现和鉴定中发挥重要作用。

1.2 检测罕见病原体

罕见病原体感染是临床非常棘手的难题，由于常规检测方法不能覆盖，往往导至误诊或漏诊。2014年Wilson等报道一名14岁的男孩，持续发热和头痛，继而进展为脑积水和癫痫，在4个月的时间里3次到医疗机构就诊，做了包括脑组织活检在内的38项病原学检查，均未发现病原体，最终运用mNGS技术诊断为钩端螺旋体脑膜炎。2015年，Wilson等利用mNGS诊断1例巴氏阿米巴导至的脑膜炎。随后有多例利用mNGS检出罕见病原体的报道：如Mai等在16岁脑炎男孩的尿液中检出日本脑炎病毒；Fung等在异基因造血干细胞移植患者血液中检出沙眼衣原体；Du等在11岁女孩的呼吸道标本中检出西尼罗河病毒等。以上研究表明，mNGS技术极大地增强了罕见病原体的检出能力，是感染性疾病诊断领域的一次革新和飞跃。

1.3 检测跨物种传播病原体

随着全球化进程，曾经局限于小范围、特定物种的病原体越来越多地发生跨地域、跨物种传播。mNGS可揭示先前无法区分的动物来源和人类来源病原体的差异，可追踪潜在的人兽共患疾病起源。如Sachsenröder等使用mNGS检测了野生老鼠的肠道标本，发现标本中有博卡病毒、沙波病毒、诺如病毒和轮状病毒等多种病原体，其中轮状病毒A株的序列与人类致病密切相关。Ai等通过mNGS诊断了一名女性因直接接触猪的污染物而感染猪疱疹病毒导至眼内炎。

1.4 检测混合感染病原体

传统微生物检验具有偏向性，只能检出部分病原体，而mNGS可无偏向性地同时检出所有感染的病原体，为患者明确诊断节省了时间。顾鹏等报道，对37例使用免疫抑制剂的感染患者使用mNGS检测，发现有31例是混合感染，病原体包括肺孢子菌、巨细胞病毒、疱疹病毒、细环病毒和细菌等。

1.5 检测培养阴性的细菌/真菌性病原体

针对细菌和真菌感染，公认的“金标准”检测方法是培养，但由于抗菌药物的应用、标本运送不及时、培养基及培养条件选择不正确等因素可能导至培养阴性。Yao等报道使用mNGS在3例常规培养阴性的脑脊液中检出产单核李斯特菌。Dai等报道在1例2次血培养阴性的患者血液标本中检出猪链球菌。此外，某些细菌/真菌用常规方法难以培养或不能培养，也可以通过mNGS进行检测，如军团菌、肺孢子菌等。

从成本效益考虑，轻症感染以及使用传统检测方法能够明确诊断的感染，如尿路感染、皮肤软组织感染，不推荐使用mNGS检测。从技术本身的局限性考虑，人源性细胞较多或背景菌较多的感染标本，如粪便标本，不推荐使用mNGS检测。mNGS技术的主要临床适应症如下。

2.1 重症感染的诊断

临床常见的重症感染有脓毒症、脑炎/脑膜炎、重症肺炎等。对于这些感染，mNGS技术有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体。Crumaz等通过对比健康志愿者与脓毒症患者的mNGS测序结果，发现在脓毒症患者血液标本中病原菌指数绝对值、丰度显著升高，且其变化与治疗效果密切相关；斯坦福大学急诊医学中心纳入580例临床诊断为脓毒症的患者，验证血浆中游离DNA用于病原测序检测诊断效能，结果发现mNGS对脓毒症病原学诊断阳性率远高于培养(48.6% vs 18.1%)，有超过85%的mNGS检测第2天可报告结果，有53.7%的报告检出超过1种以上的微生物；Xie等研究发现mNGS可以早期确定重症肺炎患者的病原体，指导抗菌药物的应用，改善重症肺炎患者的病死率。关鸿志教授团队应用mNGS在脑脊液中检出人疱疹病毒、新型隐球菌、布鲁菌等多种病原体。

2.2 慢性感染的诊断

慢性感染通常反复发作，较难治愈。由于慢性感染的症状不典型，机体间断性排菌，临床实验室检测困难。Wilson教授借助mNGS诊断1例患有慢性复发性脑膜炎16年的患者，发现其病原体为猪带绦虫，后续血清学实验也支持其诊断。Huang等利用mNGS诊断1例慢性骨关节结核感染。

 2.3 疑难复杂感染的诊断

因mNGS检测无偏倚性和全覆盖性，对疑难感染病例诊断具有重要作用。如1例非洲务工回国人员出现反复发热、头痛、嗜睡，华山医院张文宏团队用mNGS技术对其脑脊液进行检测，最终确诊为锥虫病，给予针对性治疗后患者痊愈出院；深圳市第三人民医院用mNGS确诊了1例罕见阿米巴脑炎。

2.4 免疫缺陷患者感染的诊断

免疫缺陷患者容易发生机会致病菌感染和混合感染，而且感染的病原体复杂多样，诊断困难。Wang等对108例免疫抑制患者的临床标本进行mNGS检测，该技术显示出良好的诊断潜力，不受免疫抑制程度的影响，指导抗菌药物治疗的成功率显著高于经验用药组(81.8% vs 52.6%)。Ye等报道1名2岁粒单细胞白血病患儿干细胞移植后出现严重的皮疹和高热，细菌培养和PCR均未检测出病原体，利用mNGS检测血液标本后发现痤疮丙酸杆菌是其感染的病原菌，进行针对性治疗后病情好转。Parize等报道一项多中心前瞻性研究，应用mNGS检测免疫缺陷患者的鼻咽拭子、穿刺液及血液等标本，结果显示mNGS较传统培养法有较高的检出率(36% vs 11%)，有更高的阴性预测值(98.4%)。

随着测序技术的发展，测序本身不再是瓶颈，关键是分析前和分析后质量控制以及检验人员和临床医师对mNGS检测影响因素的了解和对检测结果的合理应用。

3.1 mNGS检测灵敏度及影响因素

mNGS检测灵敏度是指单位体积标本中检测到1条病原体序列所需要的病原体个数。需要的病原体个数越少，则灵敏度越高。mNGS检测灵敏度与测序数据量(检测总序列数)及致病微生物基因组的碱基数呈正相关，与单位体积标本中人源细胞含量及背景微生物基因数呈负相关。所以，提高mNGS灵敏度的有效方法是增加测序数据量、采取适当的方法去除人源性细胞、严格控制标本质量、减少环境和试剂中的背景微生物等。在测序数据量确定的情况下，以下因素可影响mNGS检测灵敏度。

(1)病原体基因组越大，mNGS检测灵敏度越高。病原体基因组由大到小的顺序是：寄生虫>真菌>细菌>病毒。

(2)mNGS检测的是细胞外游离DNA(cell free DNA,cfDNA)，胞内寄生病原体(如布鲁菌、伤寒沙门菌等)因其胞外cfDNA较少，检测灵敏度较低。

(3)细胞壁厚的细菌，如新型隐球菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)，难以破壁，核酸提取效率低，mNGS检测灵敏度低。标本中不同病原体核酸提取效率由高到低的顺序是：病毒>革兰阴性细菌>革兰阳性细菌>真菌、MTB。

(4)常规的DNA宏基因组测序方法不能检测RNA病毒，如果怀疑RNA病毒(如乙型脑炎病毒、流感病毒、轮状病毒、冠状病毒等)感染要采用宏转录组测序。与来自细菌和宿主的RNA相比，RNA病毒遗传物质的丰度相对较低且容易降解，因此，mNGS对RNA病毒的检测灵敏度较低。

(5)临床标本中人源细胞占比越高，mNGS检测灵敏度越低。一般而言，人源细胞占比由少到多的顺序是：脑脊液<肺泡灌洗液<血浆<痰液<胸腹水。即使是同一种类型的标本，若来源于不同个体，或来源于同一个体不同取材方法或不同取材时间，人源性细胞的比例都会相差几个数量级。有些标本如粪便、坏死组织等，因背景太杂，在目前的技术背景下不适合做mNGS检测。

(6)临床标本中背景微生物占比越高，mNGS检测灵敏度越低。背景微生物主要由定植和污染微生物组成，其中定植微生物指能在人体一定部位定居、生长和繁殖的微生物。背景微生物不仅影响mNGS的结果，对传统病原学检测结果也有影响。由于mNGS检测灵敏性高，可在原本认为无菌的部位检出微生物序列，如健康人血液，因此，需通过大数据分析，建立不同类型标本的背景微生物库，定期更新，并设立基线，解读规则，以区分致病微生物和定植微生物。污染微生物指在标本取材或实验室检测过程中混入的环境微生物，可通过规范取材方法、设置阴性对照等方法减少和识别污染微生物。

3.2 微生物种类与结果判读

mNGS检测具有无偏向性和超灵敏性的特点，即使针对无菌部位的标本，一次检测也可以匹配到多种微生物的序列。需要根据检测的微生物种类、序列数(reads)、参考疑似背景微生物库、阴性对照、临床特征进行综合判读。

(1)检出明确的致病菌，如MTB、诺卡菌、流感病毒、新冠病毒、曲霉、新型隐球菌等，即使序列数较低也可能是致病性病原体。(2)检出条件致病菌，如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、链球菌等，需要结合标本类型、序列数、微生物排名、动态变化及临床诊断综合判断。(3)检出常见呼吸道定植菌和皮肤定植菌，如草绿色链球菌、干燥奈瑟菌、白念珠菌、痤疮丙酸杆菌，一般不考虑为致病微生物，除非序列数特别高，并与临床症状吻合。(4)检出罕见特殊病原体，如炭疽芽胞杆菌，当症状、体征与临床认知不符时，可使用Sanger测序、PCR方法或结合抗原/抗体检测进一步验证。

3.3 mNGS检测序列数与结果判读

序列数指匹配到该病原体的序列数目。序列数的多少与标本中病原体含量多少、病原体基因组大小、标本中核酸提取量呈正相关，而与标本中人源序列比例呈负相关。不同的病原体具有不同的序列数特点，要结合病原体的种类、序列数目、病原体排位等信息对每个病原体逐个分析，进行报告。

(1)一般细菌：mNGS检测到某种细菌(种水平)的序列数是其余所有细菌的10倍以上，有临床意义。

(2)真菌：mNGS检测到真菌(种水平)的序列数是其余所有真菌的5倍以上，有临床意义。

(3)MTB：为明确致病菌，环境污染的可能小。此外，因MTB为胞内致病菌，细胞外游离DNA少，且MTB核酸提取效率低，mNGS只要检测到1条属水平的MTB复合群序列，且能排除其他标本携带污染，就有临床意义。

(4)非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)：NTM可能是环境中污染菌，若检出，需结合背景微生物库和mNGS原始细菌列表进行结果判读。若排除污染后属水平或种水平序列数排名前十，则有临床意义。

mNGS能无偏倚性检测各种病原体，弥补了传统病原学检测方法的不足，在感染性疾病的诊断中显示出巨大的临床应用价值，已被多个指南和共识推荐。目前，mNGS临床应用仍面临一些问题，需要不断完善，如：标本的采集、核酸提取、基因文库构建、试剂选择、测序数据量和生物信息分析(参考数据库和数据算法)等缺乏标准化，测序过程和测序结果没有质控标准；标本前处理操作复杂繁琐，涉及多次转管和移液操作，费时较长，容易出现操作失误和样本污染；mNGS能检测到某些耐药基因和毒力基因，但由于测序深度不够，尚不能检测所有的耐药和毒力基因，也不能确定检出的耐药基因/毒力基因与感染菌的相关性，存在较高的假阴性和假阳性；另外，检测成本较高，外送检测周转时间(turn-around time,TAT)较长。且mNGS作为一种新型检测方法，阳性结果仅代表临床标本中检出某病原体的核酸片段，无法确定该病原体与感染之间的关系，在有条件的情况下，还应用其他方法或者感染相关的标志物进行验证。因此，mNGS尚不宜作为常规检测技术，需要掌握适应症。随着测序技术的发展以及越来越多的医院临床实验室自主开展mNGS检测，建立规范化检测流程和结果判读标准已成为业内专家的共识。预计在未来5～10年内，mNGS操作将更加自动化，流程更加标准化，成本亦将显著降低，有望成为感染性疾病病原学诊断的常规检测技术。

致谢：感谢陈昊(杭州杰毅生物技术有限公司)和麻锦敏(深圳华大因源医药科技有限公司)对本文的建议和指导。