诊断试剂评价系列4-最低检测限，你做对了吗？

前面讲了很多的试剂评价的内容，但是通常情况下我们评最关注的是试剂盒的最低检测限（LOD）/分析敏感性/灵敏度。尤其对于qPCR试剂盒的评价，到底能测到几个拷贝呢？试剂盒一般都写1个拷贝，真的都是1个拷贝吗？

最低检测限（LOD）的检测通常分为两步:

1. 梯度稀释法

   使用定值的标准物质10倍倍比稀释，每个浓度重复3-5个重复，获得全部为阳性的最低浓度，如下图所示。

   

   这是我们目前最常用的获得LOD的方式，但是其实有几个问题：第一.使用没有量值的或量值不准的样品进行倍比稀释，我们无法得到试剂盒精确的LOD；第二.10倍倍比稀释通常无法区分目前市场上主流qPCR试剂盒；第三对于低浓度样本，重复性不好，结果带有随机性。最后的结果是我们仍然无法确定LOD。

2. 95%的概率法

   LOD可以定义为不低于95%的置信区间区别于0的最低检测浓度。

   
   

   

   这是OIE里面的一个例子横坐标是稀释度，从左向右稀释度由大到小（浓度由低到高），纵坐标是出现阳性的概率。大家可以看到浓度越低检出阳性的概率越低，浓度越高检出阳性的概率越高，到达一定浓度后100%的检测都是阳性。为什么会这样呢？用我喜爱的醪糟汤圆给大家举例。

如果我煮一锅的汤圆，一共有500ml水，我的勺子容量是50ml，每勺可以装盛10个汤圆，汤圆在锅里呈自由运动。当我往锅里放100个汤圆时，我每次大概率都可以盛到汤圆；但是如果往锅里只放10个汤圆时，每次盛到汤圆的数量按照一定的概率出现，我有可能一个也盛不到，也有可能能一次盛到1个到10个，但是大概率是盛不到或盛1个，每一次盛汤圆都是一个独立的事件，每次能盛到几个汤圆是无法预测的，但是盛到几个汤圆的概率是可以计算的，这种概率符合泊松分布的规律，大家有兴趣可以去了解一下。

回到我们的LOD，当样本浓度足够低时，我们每次从核酸溶液中能吸到的模板量都是随机的，并且都是独立事件。所以当我们仅做3次重复时，每次重复的结果可能都不一样。根据我们实验室获得的数据1 copy模板对应的Ct约是38，Ct值在35以后的检测结果呈现随机现象。 下面左图为数字PCR检测结果，右图为对应的qPCR扩增曲线。

情况1：1L水中有20个汤圆，我用50ml的勺子分20次将汤圆全部盛出，那么我可以获得盛到汤圆的概率。

情况2：10L水中有200个汤圆，汤圆密度与情况1一样，我仍然用50ml的勺子分20次盛汤圆，两次盛到汤圆的概率是不同的。

我更推荐用第一种情况，在我们稀释样品做倍比稀释时，样品量够20次的上样量最佳。

如果没懂，买一袋汤圆试一试！