【直播精选】mNGS共识解读

《mNGS共识》近日发表在中华检验医学杂志，该共识汇集了全国六十多位临床和实验室的专家，包括了感染、呼吸、重症、微生物学等多个学科。今天因为时间的关系，我们请了三位主要的执笔者作为主讲，当然还有其他的撰写者，我们也一并致谢。

mNGS由于技术有难度，临床的适应症、结果解读方面不少同仁都存在困惑或质疑，因此我们组织这场《mNGS共识》解读活动，同大家一起分享和讨论。我们非常荣幸地请到了一位重量级的专家陈佰义教授，和我一起来主持。

国内近五年，mNGS技术有大规模应用，但没有标准化，有的有误导，国际上也没有国内应用的这么广，面对二者的反差，王辉教授想牵头从质量角度，获得共识、给出建议，初稿题目《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测的质量管理规范中国专家共识》，后来落实审稿专家建议，改为现名《mNGS共识》。该共识由三个学组;中华医学会检验医学分会临床微生物学组、中华医学会微生物学和免疫学分会临床微生物学组、中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会多个专家评议，历经7稿修改终成共识，最终发布于中华检验医学杂志。

该共识王辉教授总负责、定稿、发起评议、通讯作者总负责，各位专家进行总的质量把关和评议，这里面每一个推荐的字斟句酌，都渗透着多个专家背后的汗水。尹玉瑶老师负责术语、投稿；我负责适应征、专家评议、直播宣传；陈宏彬老师负责标本、分析中环节；鲁炳怀老师负责解释、分析后环节、公众号宣传涉及到的编写组的成员是多达68位，杜斌教授也参与了，但是杜斌教授后来没署名，我们在致谢里向杜斌教授致敬，向各位专家致敬。

宏基因组高通量测序技术总的指导思想是没有禁忌和明显不合理的情况下，从宽。从临床角度，这是明天的技术。不是今天的技术。定义明天，一定是从宽。目前没有国家和地区（包括中国国家药品监督管理局、FDA、欧洲药品监督管理局）正式批准mNGS用于临床感染性疾病的病原诊断。所有mNGS结果原则上都需要其他方法验证。

临床适应征部分2-7是6种情况：发热、危重、免疫受损、局部、疑似感染治疗无效、慢性病；8是不反对大撒网，反对的是无条件普遍进行的大撒网；8强调会诊，其他文献也有这一条建议。

耐药性的分子生物学检测包括PCR、探针/芯片、mNGS，耐药性的分子生物学检测（指PCR方法为主的核酸扩增方式）于2019年正式写入CLSI M100文件。mNGS耐药性检测结果难以解释，尤其是检测标本采集自正常情况下就有微生物定植或污染的部位。mNGS的耐药性检测适应征见共识14、15。流病和感控适应征：出现某种疾病的聚集性疾病或暴发，怀疑是微生物导至的感染性疾病但病原不明，且常规快速检测无结果时，建议完善常规检测的同时或在其基础上开展mNGS明确致病微生物，见共识16、17。

国际上目前有设备指南，有技术指南，但没有专门的临床实践指南，没有专家共识和其他临床实践指南。国内没有专门的指南，目前已有6个共识，大家也可以对照、参考。

最后特别向我们的几个学会学组致敬，向我们参与这次共识撰写的各位专家致敬，特别感谢中华检验医学杂志，希望大家提出意见和建议，谢谢大家。

我们复习几个重要术语, 宏基因组高通量测序（mNGS）：m指宏基因组（metagenome），是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称。mNGS指对标本中的全部生物基因组进行测序。我们还应该掌握微生物组（Microbiome）、试剂盒基因（Kitome）、游离脱氧核糖核酸（cfDNA）、读长（Reads）或称序列数、比对(Alignment)、文库（Library)、深度、覆盖率、相对深度、Q值。Q值我们通常看Q30，它是指99.9%的准确率。

我们规范标本采集之后，不需要进行培养，直接提取标本里的核酸（DNA或RNA），如果提取DNA可能除了有微生物的核酸之外，还有相当一部分是人的核酸。之后建库，包括片段化、加一些测序接头等过程，随后上芯片、测序、分析，形成最终报告。

除了 NGS之外，还有靶向测序，如果大家做过菌群分析的，比如肠道菌群或者呼吸道菌群分析，可能对这个就非常清楚，如果你要做细菌，这时候你们就做16SV3V4区或23SRNA的测序，然后再进行高通量测序，如果说要做真菌，然后我们做18S、21S或ITs1，然后再进行高通量的测序，这是靶向测序。

测序后要进行生物信息学分析，去除低质量、低复杂度的序列和接头去掉，去掉人的序列，得到物种信息，检测耐药基因毒力基因等。不同的NGS测序平台有各自的优缺点。

1、注意标本采集：严格无菌操作，避免污染；无菌、无核酸容器留取标本；mNGS RNA-seq：添加核酸稳定剂；快速送检，如不能快速送检，保存于低于-70℃冰箱或液氮（血液标本应分离血浆后保存）。见共识18.

2、mNGS-DNA/RNA提取：不同试剂盒对不同病原体的提取效能不同；高宿主背景标本需要去除宿主核酸，但去宿主核酸要小心，它是双刃剑，它对微生物核酸也有影响，降低敏感性；同时注意部分污染可能来自核酸提取试剂盒。见共识19.

3、mNGS-建库和测序：建库慎用各种扩增方法，因为扩增会使正常菌群或污染病原体的序列扩大，难以判断真正病原体；同时注意测序原始数据应进行质控，并且过滤掉低复杂度、低质量的序列，不同测序平台，错误读取碱基的概率不同，进行RNA测序比DNA测序更有益，但更耗时。见共识20.

4、mNGS-生信分析：mNGS最大的瓶颈是污染导至假阳性，要特别注意污染问题，我们推荐一些解决策略：根据临床微生物专家和临床医生的指导添加解释性注释，使用替代方法确认由mNGS新鉴定的物种；实施污染监测策略，例如专用的污染参考数据库；设置阴性对照；临床微生物和专科医师（临床微生物测序委员会）结合临床实际与主管医师讨论检测结果。见共识23.

5、注意测序深度对结果的影响（共识24）和疑似背景微生物对mNGS的影响，如背景库中微生物具有临床意义，报告时需更高的报告阈值（共识25），而mNGS病原诊断阈值的设定依据实验流程、生信分析流程不同，病原诊断阈值不同，亦因为不同标本类型、不同病原体的诊断阈值可能不同。（共识26）

6、数据库对mNGS结果的影响：实验室应验证自建的数据库中物种的准确性，过滤数据库错误和不正确的序列，并定期更新数据库；真菌和寄生虫拥有庞大基因组，可与人类宿主读长相混淆，并且可能低滴度存在于临床标本中，给mNGS带来挑战。假阴性也可能是数据库中缺少某物种所致（共识27）

7、mNGS检测耐药基因是一个挑战，我们要注意首先需要定位耐药基因来自哪个物种，耐药基因位于质粒上还是染色体上，背景微生物中也含有耐药基因，有可能造成假阳性。另外要考虑质粒可以在不同菌种之间传播，如果耐药基因位于质粒上，确定耐药基因来自哪个物种比较困难

8、mNGS—性能验证：对 mNGS整个检测和分析流程进行性能验证是其应用于临床的瓶颈，建议对感染性疾病常见的“代表性”物种进行检出限、包容性、抗干扰、精密度、携带和交叉污染、稳定性等的验证 。（共识28）

1、我们对mNGS既恨又爱，对于常规容易培养的病原菌的检测，并非mNGS优势所在，mNGS在少见病原体、难培养或无法培养的病原体、新发病原体引起的感染方面有其优势。

2、mNGS步骤繁多，影响因素颇多，目前急需标准化。

3、mNGS结果解读应结合患者临床表现、其他微生物学检测，由临床感染病医生、临床微生物医生（最好懂一些生信分析）共同去解读结果。

4、在mNGS蓬勃发展的今天，传统方法仍然不能放弃，相互印证。

正确解读建立在合格的样本的基础上。解读报告考虑如下参数：测序质量（是否去除低复杂度、低质量序列，Q20、 Q30 等）、读长、特异性读长、覆盖率、深度、丰度、微生物序列的数据量、阈值等。要确定报告合格、可信。（共识29）

在mNGS 检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒（有些无症状儿童可能检出腺病毒）、流感病毒，关节液或血液标本检出布鲁菌属，均可认为是致病微生物。注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。（共识30）

1、血浆样本对cfDNA进行mNGS检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症（共识31）。血液样本检出曲霉菌或其他真菌的游离DNA，并不意味着此类微生物入血，可能是游离的 DNA入血所致，和侵入性真菌感染有较大相关性。

2、注意感染诊断的多种方式，即关注新技术，也不忽视传统方法，传统与精准相结合：mNGS报告中常规容易培养的病原菌，建议临床医师结合传统方法，综合判断其临床价值（共识32）。建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌）等，即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证，如特异引物的PCR 或一代测序等分子生物学检测，G 试验，GM 试验，曲霉菌IgG抗体或隐球菌荚膜多糖抗原等血清学试验（共识33）。mNGS对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。建议解读报告单前应了解比对数据库的内容，明确其是否涵盖少见病原或新发病原。检出高致病性病原微生物，应及时与临床联系（共识35）。mNGS 结果为阴性，对于排除感染常具有较好的阴性预测值。但对于某些病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物，应考虑 mNGS 检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于PCR等常规检测方案（共识36）。

3、不能仅仅依靠读长多少来判断是否感染，建议同时考虑病原微生物种类差异与致病特性。同等条件下（相同微生物，相同标本），如某一微生物检出的读长数量多，为致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因组大小不同（寄生虫>真菌>细菌>病毒），核酸提取效率存在差异［难易程度：病毒<革兰阴性菌<革兰阳性菌（不包括分枝杆菌、需氧放线菌等）<真菌］，致病力也相去甚远（共识38）。建议各实验室建立自己的阈值，并在临床工作中加以验证。（共识37）

4、 mNGS病原微生物检测结果，建议由具有一定生物信息学知识，并从事临床感染或临床微生物等专业人员，结合患者临床背景、影像学资料、其他的实验室检查结果，综合判断。不加以正确解读与甄别，盲目依据mNGS报告开展治疗，必将导至抗微生物药物的滥用。（共识39）

最后强调，从事临床感染与微生物的医疗人员应加深对临床微生物与感染的认识，这样才能够更好的解释mNGS报告，给患者带来更多的益处。否则盲目使用mNGS 测序，会带来更多问题。

作为一名ICU医师，危重症感染患者的救治是我们日常工作之一。若患者发展成为脓毒症或脓毒性休克，则死亡率可高达50%，尤其是以免疫抑制宿主包括风湿免疫性疾病，实体器官移植受体继发感染为主要收治对象的机构。

最初我们对于NGS技术的理解主要有两个：

1、可以检测到通过常规培养方法无法分离出的病原体，因为在2016〜2017年间如Film-Array，X-pert，或各种Pannel没有像目前应用这么广泛。其次需要注意的是，对于免疫抑制宿主，经培养方法检出的微生物未必一定是病原体，可以存在定植甚至污染的情况，但更重要的是，经培养出的微生物未必是唯一病原体，比如在免疫抑制宿主中常见的病毒-真菌共感染情况，如：PJP+CMV，曲霉+CMV或PJP+曲霉等，利用NGS与传统检验方法相结合，可以防止漏诊。

2、对于感染患者，尤其是经初始抗感染治疗效果不佳转为危重症患者，通常会使用“广覆盖”的抗菌药物使用策略，诊治关键是需要明确是否为感染性疾病，感染的病原体是哪种。比如糖尿病患者发热，咳嗽，肺部CT提示有空洞，GM试验升高，首诊医师的第一印象可能会考虑是肺曲霉菌病，但未必，也有可能是ANCA相关性血管炎在肺内的表现。那通过NGS检测阴性的结果，当然是在覆盖度比较广的前提下，可以初步排除感染。当然，当初次NGS阴性，经治疗效果不佳仍考虑感染性疾病时，可以再次送检。

所以NGS结合传统的实验室方法对于重症感染患者的病原体检测提供了很大的帮助。接下去的问题就是对于报告的解读，有时报告提供的信息过少，比如告知有3个疑似可能的病原体，临床医生觉得已经使用的抗菌药物均可以覆盖，但治疗效果不好，可能会要求看这个测序的原始数据。另外就是给的信息很多，给临床医师带来了很多的困惑，检出的有可能的病原体都需要去覆盖？另外就是对于检出序列数的判断，比如真菌。大家都知道真菌破壁困难，同样感染的情况下，NGS真菌检出的序列数相对较少，那么需要多少的序列数作为cutoff值可以使临床启动抗真菌治疗，仍需要进一步探讨。

所以，NGS结合常规检验技术对于临床危重症感染患者的病原体检测提供了很大的帮助。临床医师需要了解基本的微生物和检测知识，了解其检测原理，根据宿主自身情况，结合实验室检查，影像学结果，NGS检测和其他传统的实验室方法，综合判断。