快速qPCR“快”和“准”能否兼得？

    检测人心中最理想的诊断试剂就是又快又准又便宜，但是通常情况下鱼和熊掌不可兼得。作为检测人我也期待着这样的产品早日出现，让我们脱离苦海，但是在这样的产品推出之前，还是希望相关公司在产品研发时能够考虑以下的因素。

一、快速qPCR试剂的评价

    快速qPCR的评价应与常规qPCR使用相同的评价标准，重复性（精密度）、分析敏感性（最低检测限）、分析特异性、诊断敏感性和诊断特异性。参见 诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正）尤其是最低检测限的参数必须明确，否则很容易翻车。

二、快速qPCR的仪器评价

    现在有些厂家基于现有的qPCR平台推出了快速qPCR产品。这就要求所使用的qPCR仪器能够满足基本的性能要求，参见 如何系统全面的评价qPCR仪。

1.鲁棒性/稳健性 Robustness：

    指在测试过程中，测试条件发生微小变化时，检测方法不受其影响的能力。 用于衡量检测方法在其参数发生少量但可预料的改变时不受影响的能力；在正常使用中，可显示方法的可靠性。最有可能影响检测qPCR鲁棒性/稳健性的因素包括定量（连续性）因素（温度等）。那么温度是如何影响的试剂性能的呢？

2.荧光定量PCR仪的温度性能试验相关指标

(1)温度示值误差  :在温度技术指标校准程序中， 实时荧光定量 PCR 分析仪均热块设定温度与所有采样测量孔温度平均值之差。 

(2)温度均匀度  :在温度技术指标校准程序中， 实时荧光定量 PCR 分析仪均热块所有采样测量孔温度平均值的最大值与最小值之差。 

温度示值误差与均匀度*

(3)温度最大过冲量 :在温度技术指标校准程序中， 荧光定量 PCR 仪均热块温度升高或降低至设定值过程中，所有采样测量孔温度超出设定值的最大幅度。仪器的温度过冲取决于每种仪器的固有性能，随着仪器的老化，温度过冲量也会发生变化。

温度最大过冲量*

四.qPCR程序下的温度性能评价试验

1.快速qPCR程序：

    根据某试剂盒的快速程序使用国产某品牌qPCR仪器：预变性95℃，3min；95℃，5sec，60℃，13sec，45个循环。在本测试中循环数设为15个循环，如下图所示，虽然我们在仪器的程序中设置了相应的温度和时间，但是由于温度的过冲，程序运行过程中的温度和时间与设置的温度和时间存在较大的差异。

快速qPCR程序*

2.快速qPCR 95℃下的温度过冲

    95℃ 3min阶段温度最大过冲2.54℃，过冲时间36s，仪器稳定在95℃的时间为2min39s；而在95℃，5sec循环阶段，温度最大过冲3.03℃，过冲时间12s；这意味着在循环阶段的实际运行过程中从未达到过稳定的95℃ 5s。

95℃温度过冲*

95℃温度过冲*

3.快速qPCR 60℃下的温度过冲

    60℃，13sec 循环阶段，温度最大过冲2.72℃，过冲时间11s；温度稳定在60℃的时间为8s，这意味着在循环阶段的实际运行条件为60℃ 8s。 

60℃温度过冲*

4.荧光定量PCR仪的温度性能指标试验

以15个监测点的温度为例进行分析（布点如下图）：运行程序为：30℃，1min；95℃，1min；30℃，1min；90℃，1min；50℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；30℃，1min。

95℃温度曲线

95℃温度性能*

60℃温度曲线

60℃温度性能*

不同温度下的温度性能。

结论：

1. 由于qPCR仪器之间的性能差异较大，所以试剂公司在研发qPCR试剂时应考虑仪器的性能差异对检测结果的影响，根据温度最大过冲量、温度示值误差和温度均匀性等指标，增加试剂鲁棒性试验。
   

2. qPCR仪器的性能评价需要包括温度性能、荧光性能和生化性能，温度性能仅是其中一个指标，还需要评价荧光性能和生化性能。

3. 要实现快速qPCR需配套高性能的仪器、专用的耗材和高效率的试剂才能真正达到快速qPCR效果，在常规qPCR仪器和试剂条件下，仅仅通过缩短反应时间来达到快速的目的往往得不偿失。

*特别感谢：本文所有实验图片均由北京林电伟业电子技术有限公司提供。