如何系统全面的评价qPCR仪

    本文是之前的文章《教你核酸检测实验室如何评价荧光定量PCR仪》的补充升级版。也以此鼓励一下居家隔离的自己和我的同事朋友们，至少大家实在太无聊的时候还可以看看我的公众号。

      荧光定量PCR的检测离不开荧光定量PCR试剂和荧光定量PCR仪器。试剂的评价前面已经讲了（诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正））。但是每次提到荧光定量PCR仪的评价，大家总是望而却步。一方面原因是荧光定量PCR仪涉及很多温度、光电信号需要专业的设备来评估，另一方面也确实不知道从哪里入手。今天我梳理一下评价荧光定量PCR仪的指标和方法。由于本人非计量相关专业，文中可能存在错误，本文仅供参考，大家可以参照相关标准进行评价。

一、荧光定量PCR仪评价的核心指标

二、荧光定量PCR仪的温度性能试验相关指标

    通过物理方法测定PCR性能的试验。主要包括测定温度和荧光来进行评价，由于需要专业的设备，建议联系计量部门或仪器厂家进行相关指标的测定。

1. 温度示值误差： 

   编辑并运行一个温度循环文件，在55±5℃，72±5℃，95±5℃各取一个温度点，设置恒温2min，测定值与设定值应不超过±0.5℃。

2. 温度均匀性：

   编辑并运行一个温度循环文件，在55±5℃，72±5℃，95±5℃各取一个温度点，设置恒温2min，5次循环，随机选取≥6个点位。温度差值在±1℃范围内。                                                                                                                 

   

   (图片由北京林电伟业电子技术有限公司提供 )
   

   
   

3. 温度最大过冲量：

   荧光定量 PCR 仪均热块温度升高或降低至设定值过程中，所有采样测量孔温度超出设定值的最大幅度，应≤3℃。过冲时间和过冲温度体现了qPCR仪器的性能，对qPCR实验程序的影响巨大，后面会用实验来说明过冲的影响。

                              
   

   

   (图片由北京林电伟业电子技术有限公司提供 )
   

4. 温度持续时间准确度：

   编辑并运行一个45℃和95℃之间循环的文件，设置温度≥1min，连续记录5个循环，温度持续时间与设定温度时间偏差在±5%以内。
   

5. 平均升温速率：50℃-90℃应不小于1.5℃/秒。
   

6. 最大升温速率：50℃-90℃应不小于2.5℃/秒。

7. 平均降温速率：90℃-50℃应不小于1.5℃/秒。

8. 最大降温速率：90℃-50℃应不小于2.0℃/秒。

三、荧光定量PCR仪的荧光性能试验相关指标

    通过物理方法测定PCR性能的试验。主要包括测定温度和荧光来进行评价，由于需要专业的设备，建议联系计量部门或仪器厂家进行相关指标的测定。

    9.荧光强度检测精密度

    随机选取10个及以上个检测孔，用高中低浓度校准染料进行检测，各浓度校准染料重复测定的变异系数≤5%。

    10.荧光强度检测重复性：

    用高中低浓度校准染料各随机选择1个孔，重复检测10次，各浓度校准染料重复测定的变异系数≤3%

    11.不同通道荧光干扰

    随机选择≥2个通道，配置非目标通道的荧光染料溶液，其他通道荧光检测强度不高于目标通道荧光阈值。

(图片来网络，版权归原作者所有)

    12.荧光线性

    将已知浓度标准荧光染料梯度稀释后（至少稀释 5 个梯度）进行测量，每一浓度梯度平行测试3孔，计算线性相关系数，应≥0.990。

四、荧光定量PCR仪的生物化学试验相关指标

    对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能试验。该指标可以通过荧光定量PCR的试验对仪器进行评价，每个核酸检测实验室都可以开展的评价试验。

     13.样本线性

     将已知核酸浓度样本按照5倍或10倍梯度稀释后（至少稀释 5 个梯度），按照项目选用对应的试剂进行检测，每一浓度梯度平行测试3孔，计算线性相关系数，应≥0.980。

    14.样本检测重复性

    对高中低浓度核酸样本进行检测，每一浓度重复检测10次，计算Ct值变异系数应≤3%。

(图片来网络，版权归原作者所有)

五、荧光定量PCR仪评价的试验设计

1.试验准备

1.1有证标准物质

国内外有证标准物质，标准物质类型为质粒DNA或RNA。不推荐使用自制没有进行定量的质控品。

1.2荧光染料

建议购买标准荧光染料。

1.3.荧光定量PCR方法

需要使用经过验证过的荧光定量方法：扩增效率90%-110%（越接近100%越好）；R2大于0.99；最低检测限应低于10 copies/反应。

1.4.反应体系

质量高口碑好的反应体系。

1.5.耗材

仪器推荐使用的专用于荧光定量PCR的耗材，经过校准的移液器。

1.6.荧光定量PCR反应条件

常规荧光定量PCR反应条件，普通模式，40个循环。不建议使用快速模式和预扩增反应条件。

2.重复性试验

选择高中低浓度标准物质进行检测（推荐浓度为5000 copies/反应、500 copies/反应和50 copies/反应），每个浓度至少5次重复，样品管随机放置在反应板中心和边缘的不同位置 。Ct值变异系数不大于3%。

样品放置的位置尽可能分散，也可以如下图。

3.样本线性试验

对已知浓度的样品进行5倍或10倍梯度稀释（至少5个梯度），每一浓度梯度平行测试3孔，Ct均值的回归系数R不低于0.99。

4.荧光线性试验

对已知浓度的标准荧光染料进行梯度稀释（至少5个梯度），每一浓度梯度平行测试3孔，回归系数R不低于0.99。

5.不同荧光通道干扰试验

如果检测中使用双重或多重荧光检测，可设计如用FAM探针扩增用VIC通道检测，检测结果不应该有高于阈值线的荧光信号。

总结：荧光定量PCR仪的评价需要结合物理性能（温度和荧光）和生化性能（荧光定量PCR反应）才能获得仪器总体的表现。需要专业的计量机构结合实验室的常用检测项目（新冠、非瘟等）对qPCR仪进行系统性评价。核酸检测实验室日常使用已知浓度的有证标准物质定期对荧光定量PCR仪进行评价也至关重要。

参考文献：

1. YY∕T 1173-2010 聚合酶链反应分析仪

2. JJF1527-2015 聚合酶链反应分析仪校准规范

3. SN/T 2102.2-2008 食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分：PCR仪性能试验要求

4. JJF(津)04-2020 实时荧光定量 PCR 仪校准规范

5. JJF（苏）222-2019 实时荧光定量PCR仪校准规范