IVD原料-常用蛋白浓度测定方法的比较

蛋白浓度测定方法有很多种,各种蛋白质含量测定的研究也屡见报道。每种方法都有其优点和局限性,在蛋白质样品中往往会含有一些化学试剂,有些化学试剂会干扰蛋白浓度测定。因此,寻找合适的实验方法以避免干扰对蛋白浓度测定的准确性至关重要。

测定原理比较

Lowry 法的测定原理为蛋白质与碱性硫酸铜作用形成铜- 肽键络合物,后者与色氨酸和酪氨酸共同作用使酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸还原生成蓝色化合物;BCA 法的测定原理为蛋白质价铜离子还原成亚铜离子,后者在碱性溶液中与BCA 结合生成紫红色络合物。Lowry 法与BCA 法同属于化学法。磺基水杨酸沉淀法属于物理法,Bradford 法属于染料结合法,即考马斯亮蓝G2250 在酸性溶液中呈红棕色,与蛋白质结合后转变为蓝色,颜色深浅与蛋白浓度呈正比关系。

用4 种方法对含有5 种不同类型蛋白质的3组样品的测定结果比较结果见表1。标准品BSA 为同一样品,3 组样品为不同批次的蛋白质。 

BCA 法测定PEG2IL26 蛋白浓度及Bradford 法测定变性液中蛋白浓度的结果分析

对Lowry 法测得的IL26 样品浓度为250μg/ mL ,加入PEG修饰后再用BCA 法测得的该样品的浓度为246 μg/ mL , 说明PEG 对BCA 法没有影响。对BCA 法测定的包涵体变性液中蛋白浓度为25 mg/mL 的样品用Bradford 法测得只有1. 59 mg/ mL ,对照试验显示包涵体变性液中的β2巯基乙醇严重干扰BCA 法,而对Bradford 法无影响。由此可见,Bradford法适于检测包涵体变性液。表2 是连续10 次对同一PEG2IL26 样品用BCA 法测定和同一包涵体变性液样品用Bradford 法测定的结果。

表2 BCA 法测定PEG2IL26 和Bradford 法测定包涵体变性液中蛋白浓度的重复性结果

蛋白浓度的测定范围

按照文献[427 ]所述方法操作,各种方法测定蛋白浓度的范围如下:Lowry 法标准蛋白浓度设置范围为10～100μg/ mL ;BCA 法标准蛋白浓度设置在20～1 000μg/ mL 时r 值仍大于0. 998 ;磺基水杨酸沉淀法标准蛋白浓度设置在50～500μg/ mL 时, r 值才大于0. 99 ,过高则产生的沉淀不易悬浮;Bradford 法为31. 25～2 000μg/ mL 。蛋白浓度测定方法的线性范围取决于所加样品中的蛋白质的摩尔数与所加试剂中有效化学成分的摩尔数之比,而非体积之比,因此,可以通过减少样品体积来提高检测范围的上限。

影响因素

影响Lowry 法测定蛋白的主要因素有某些氨基酸、NH+4 、兼性离子缓冲液、非离子表面活性剂、蔗糖、含硫化合物;影响BCA 法测蛋白的主要因素有蔗糖、NH+4 、尿素、EDTA[7 ] ,磺基水杨酸沉淀法虽然克服了以上各种因素,但是不同的蛋白所形成的沉淀性质差别很大。如本试验所显示,用牛血清白蛋白作标准测定破伤风类毒素和IL26 蛋白含量误差可超过100 % ,且蛋白浓度越小误差越大,因此用此法测定蛋白含量时应选相同的或性质相近的蛋白做标准。影响Bradford 法的主要因素有甘油、乙酸、去污剂和一些碱性缓冲系统。

由于用Lowry 法测定PEG2IL26 时会产生黄色沉淀,并且迅速沉淀到管底,无法用分光光度计测得均匀的吸光度。所以,测定PEG2IL26 等PEG化的蛋白浓度时不能采用Lowry 法,但可以采用BCA 法。包涵体的变性液和复性液中经常会含有尿素和β2巯基乙醇,这些物质会干扰BCA 法的测定,所以BCA 法不适于含有尿素和β2巯基乙醇的变性液中蛋白含量的测定。

根据表1 可知,磺基水杨酸沉淀法对每种样品检测偏差都较大,因此,沉淀法必须用与样品同质的已知蛋白含量的对照品测定,也不适于检测PEG2IL26 和变性液蛋白测定。

通过表2 的结果显示,BCA 法检测PEG2IL26 的干扰少重现性高( RSD <5 %) ,而Bradford 法可以不受变性液中的还原性物质干扰,对包涵体变性液中的蛋白浓度的检测比较准确,且重现性好( RSD < 5 %) 。

因此,对于PEG2IL26 等PEG修饰后的蛋白浓度测定最好采用BCA 法,而对于包涵体变性液这种含有还原性物质的样品,其蛋白浓度测定最好采用Bradford 法。

为了帮助大家选择正确并且简单的方法测定蛋白质的浓度，汇总三种常用的蛋白质含量测定方法的原理及注意事项。

BCA（Bicinchoninic Acid）法

BCA方法是近年来广泛应用的蛋白质定量方法。其原理是，在碱性环境下蛋白质与二价铜离子络合并将二价铜离子还原为一价铜离子。BCA与一价铜离子结合形成稳定的蓝紫色复合物。该复合物在562 nm处有较高的吸光值，并与蛋白质浓度呈正比。不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线。BCA蛋白质测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。BCA方法适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测，可兼容高达5%的SDS，TritonX-100及Tween等。然而，由于BCA方法依靠铜离子进行显色反应，如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTT、β-巯基乙醇，结果将受到很大程度的影响。同时，BCA方法的检测结果也会受到蛋白质内半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影响。

Bradford法

Bradford方法是由Bradford于1976年建立的。第一篇描述Bradford方法的文献目前已经被引用数千次，这充分说明了Bradford方法的价值。该方法的原理是，带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。考马斯亮蓝在溶液中显红色，吸收峰在465nm处，当与蛋白质结合后，其显蓝色，在595nm处有吸收峰。595nm处的吸光值与蛋白质的浓度呈正比。在应用Bradford方法时需要注意的是，由于不同蛋白质碱性氨基酸的含量不同，因此Bradford方法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少偏差。另外，不像BCA方法，Bradford方法受到SDS、Triton X-100等试剂的影响。

紫外分光光度法

简单但常常不可靠。这个方法通过测量蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸在280nm处吸光值来估测蛋白质的含量。蛋白质浓度根据Beer-Lambert定律计算。

A=E•C•l

A代表吸光度，E代表消光系数，C代表蛋白质浓度，l代表光径长度。消光系数可以根据蛋白质序列估测。

这种方法之所以不可靠有两个原因。

第一，不同的蛋白质含有不同的酪氨酸和色氨酸含量。故要准确测量，必须要有待测蛋白质的纯品作为参考。

另外，这种方法会受到在280 nm处有吸光值的物质的影响，包括一些buffer离子，核酸，乙醇等等。其中尤以核酸的影响最为严重。核酸的最大吸收峰在260 nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260和OD280，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响。本法操作简单迅速，且不消耗样品，多用于纯化的蛋白质的微量测定。

对于蛋白质浓度测定，了解测定方法的机理很有必要。这里简述了三种方法的原理及注意事项，希望对您有所帮助。如有任何建议，请在公众平台留言。

参考文献:

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[8] 　李海玲, 彭书明, 李凛, 张雪梅. 4 种常用蛋白浓度测定方法的比较