小编整理了几种常见手工提取核酸的方法与原理,希望各位看官结合自己的实际工作。了解自己常用提取试剂的基本原理,清楚提取过程中的关键步骤,来一次愉快且完美的核酸提取。 1869 年,瑞士医师 Friedrich Miescher 首例成功的进行了核酸提取。首先从脓细胞分离出细胞核,用碱抽提再加入酸,得一种含氮和磷特别丰富的沉淀物质,当时曾叫它做核质。 1872年,又从鲑鱼的精子细胞核中,发现了大量类似的酸性物质,随后有人在多种组织细胞中也发现了这类物质的存在。因为这类物质都是从细胞核中提取出来的,而且都具有酸性,因此称为核酸。 上世纪20年代,德国生理学家科赛尔(Kossel,A.1853-1927)与他的学生研究发现核酸的基本组成单元:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)。 1929 年,该团队又确认核酸有两种:脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)。 1928 年,生理学家费格里菲斯(Griffith,J),在研究肺炎双球菌时,提出猜想:核酸是一种转化因子。 1944年,细菌学家艾弗里(Avery,0.T。1877-1955)证实了费格里菲斯的猜想,即核酸就是一种转化因子。 1952年,赫尔希(Heishey,A.D.)和蔡斯(Chase,M)用同位素标记的方法进一步确认:DNA就是遗传物质基础。原 1953年2月28日,在英国剑桥的伊尔酒馆(Eagle)酒馆,克里克宣布建立了DNA双螺旋结构分子模型。同年4月25日和5月30日刊登于《自然》的两篇论文:《核酸的分子结构—脱氧核糖核酸的结构》和《脱氧核糖核酸结构的遗传学意义》标志了分子生物学和分子遗传学的时代已经到来。 CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵):一种用于富有机体基因组DNA的有效方法。 原理: CTAB是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 碱抽提法:一种用于质粒提取的经典方法。 溶液Ⅰ:50mM 葡萄糖/10mM EDTA/25mM Tris-HCl,pH=8.0; 溶液Ⅱ:0.2M NaOH / 1% SDS; 溶液Ⅲ:3MKAC/ 2M HAC。 过程:溶液Ⅰ悬浮细胞(大肠杆菌);溶液Ⅱ快速使细胞破裂(NAOH),其中SDS大量与蛋白质结合;溶液Ⅲ置换出SDS中的Na离子形成不溶于水的PDS(基因组DNA在此时被共沉淀);质粒DNA则溶于水相中。 TRizol法(异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法):由Piotr Chomczynski和Nicoletta Sacchi发明的一种简单便宜的RNA提取试剂。此方法获取RNA简单方便。因此,也开启了RNA研究的热潮。 TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。 |