杂谈丨IVD企业参考品

无聊的小编最近统计了一下《医疗器械监督管理条例》的高频词汇（数的准不准不重要，重点看条例精神），除了“医疗器械”这个绝对主角出现347次外，“应当”一词出现了117次屈居第二（意思也很明白，众企业听令的意思）。

接下来重点来了，“有效”出现32次、“安全”出现29次，并且条例开篇第一条即点明了政府对于医疗器械产品（含IVD）的最重要的两点要求——安全！有效！

对于我们IVD产品而言，有效的产品本身就是在保护受试者的安全。因而，在IVD产品的研制、生产和使用过程，最重要的事情就是确保产品有效——稳定、持续的有效。

在确保产品有效性的过程中，企业参考品担任“标尺”的角色，好的企业参考品能够准确衡量产品的性能，如同一把量程适中的标尺一样。但是在现实操作过程中，却未必都设置了符合要求的参考品。比如预期用途为粪便中病原菌抗原检测的试剂，选择纯细菌培养物作为参考品，就有可能无法准确复现临床应用过程中产品的最低检出限。

本文针对定性产品，将企业参考品相关的内容单独摘出来，与大家分享一下，限于经验阅历，不正之处欢迎交流与指正。

首先，原材料是产品质量的基础。对于原材料如何进行评价、如何确定质量标准，每个企业都有自己的方法。实际操作过程中，多数企业均是使用企业内部参考品作为评价标准。抗原、抗体、探针、酶等主要原材料除了进行纯度、活性等方面的指标检测外，最重要的是进行功能性试验（功能性试验通常将原材料组装成试剂盒小样，使用企业内部参考品进行检测）来筛选和评估原材料。

其次，对于生产工艺和反应体系的确定也主要依赖于企业内部参考品。主要生产工艺包括引物探针、酶、抗原、抗体的浓度；包被时间；显色系统浓度和用量等。主要反应体系包括被测样本用量、试剂用量、反应的温度、湿度、时间等。通过企业参考品评估比较不同的生产工艺和反应体系，最终确定最佳方案。

因而合理设置企业内部参考品是非常重要的。如果参考品的设置不合理或者存在缺陷，那就会造成整个产品的原材料选择、生产工艺的确定和反应体系的组成均存在较大的问题，导至产品的质量不能达到临床使用的安全性和有效性，容易在临床检测过程中出现错误结果而影响临床的诊断和治疗。

原则要求申请人应提供企业参考品的详细制备过程，包括组成、来源、毒株特性（如名称、型别、浓度）、溯源及定值资料等信息。本部分简要介绍通常情况下至少需要包括的四种参考品。

1）阳性参考品

主要可反映产品检测的灵敏度以及对不同型别被测物的检出能力。

（1）应尽可能包括强阳性参考品、中等阳性参考品、弱阳性参考品。

（2）应尽可能包括临床样本中所有可能检测到的型别及亚型。

（3）应使用金标准或适当的方法进行确认，包括被检测物的存在以及浓度。

如原则规定“阳性参考品应包含DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4型标准毒株或临床分离株”

2）阴性参考品

为不含被测物的阴性样本，主要用途是反映产品检测的特异性。

（1） 高值阴性参考品，可以验证产品检测的稳定性并可进一步验证产品Cut Off值的设定是否合理。

（2） 含有可能会产生交叉反应物质的样本（可能与被测物同源性的病原微生物、抗体等，对于微生物检测还应具有采样部位正常可能寄生的微生物，以及引起相似临床症状的病原微生物），对反映产品检测的特异性十分重要。

（3） 治疗药物干扰的样本，包括对于该检测项目可能的治疗药物及含有常规治疗药物浓度的样本。

（4） 应使用金标准或适当的方法进行确认，确认该检测物为阴性。

如原则规定“阴性参考品则主要涉及对分析特异性（交叉反应）的验证情况”

3）最低检测限参考品

评价定性产品检测下限的依据，是评价产品检测能力的重要工具。

（1）如被测物包括多个型别和亚型，至少选择三个主要型别或亚型进行设置。

（2）最低检出限是评价产品批间一致性的重要指标。因此，必须对最低检出限参考品进行被测物的定量或半定量，确保其自身的批间一致方能发挥作用。

（3）可以采用药监局已经批准上市的产品、质量较好的同类定量试剂对参考品进行定值。如该检测项目存在国家或国际的定量标准品，则应对该参考品进行量值的溯源。如该检测项目没有定量检测试剂可以进行参考，则可以采用其它方法或金标准的方法对参考品进行定量或半定量。

4）精密度参考品

可反映产品检测的重复性以及重复检测的稳定性

（1） 应是包括被测物的主要型别不同浓度的样本。

（2） 检测次数一般10次左右，次数过多或过少均无法客观反映产品检测的重复性。

如原则规定“精密度参考品应至少包含两个浓度水平，其中包含弱阳性水平。”

基质效应

正如军事训练的原则“仗怎么打，兵就怎么练”一样，企业参考品应尽可能与临床检测的样本一致，如此才能客观准确反映试剂的有效性。

参考品的基质应与临床被检样本相同，如完全相同基质的样本不易获得，应采用尽可能与临床被检样本基质接近的样本，并对样本的基质效应进行详细的研究。

《YY/T 1652-2019 体外诊断试剂用质控物通用技术要求》中对“基质效应”有如下讲述：

理想状态下，质控物的成分应尽可能的接近人样本的成分，从而最小化基质带来的影响，正确反映样本的检测值。

在实际研制中，为了减少消耗，更加方便和安全，会对基质进行一些改变。例如，动物或合成的基质被用来保护实验人员不受感染病原体的侵害；防腐剂，稳定剂，抗菌剂和澄清剂也会被加入来增加质控物的易用性和稳定性；生产过程（例如，冻干或灭活）能够显著改变质控物的物理，化学和生物特性。尽管各种基质和添加剂有益处，但是这些与人样本的差异可能会导至质控物不能完全反映人样本的检测性能。因此，建议制造商在研究过程中对质控物的基质进行评价，在质控物基质和人样本中平行加入能覆盖测量范围的被测物，比较这些结果来确定质控物基质相对于天然样本的偏差、精密度差异和稳定性差异等。必要时可参考CLSI指南EP-14、EP-30进行基质效应评估。

参考物质的来源

（1）WHO是世界上体外生物诊断试剂参考物质的主要提供商，长期致力于高品质的国际参考物质的研发工作，为各国提高体外诊断检测体系的准确性和可靠性提供支持。在其已经发布和正在研制的参考物质中，大约95％由英国国家生物制品检定所（The National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）提供。

（2）在我国，国家药品、医疗器械（包括体外诊断试剂）等标准物质的研究、方法和管理工作由中国食品药品检定研究院（简称：中检院）负责。目前查询入口为http://aoc.nifdc.org.cn/sell/home/search.html。

（3）如果没有国际和国内同类别的参考物质提供，那就需要充分发挥大家的聪明才智，结合上述的主要原则进行设置。在制备过程中可以借鉴中检院的思路，比如《人类白细胞抗原B27 核酸检测国家参考品的建立》一文讲述的国家参考品的建立过程。

文章中对样本来源如何描述（志愿者！）、如何进行定制、如何进行稳定性研究等都讲得很清楚。

文章摘录

董劲春老师在《定性检测用体外诊断试剂的企业内部参考品的设置》中提到：

（1）阳性参考品的制备可将强阳性参考品使用健康人的阴性血清进行系列稀释得到不同稀释度的阳性样本，该稀释用阴性血清不能对产品检测产生不利的影响。同时还应在临床样本中选择不同阳性强度的样本直接作为参考品。

（2）选择不同型别的强阳性样本作为基础样本，使用健康人的阴性血清对强阳性样本进行倍比稀释得到一系列稀释度的样本，该稀释过程必须保证样本的基质保持不变。使用待评价产品对不同稀释度的参考品进行检测，每个稀释度参考品至少检测三次，直至检测为阴性结果为止。检测为阳性的最高稀释度参考品为最低检出限参考品。

（3）在技术审评过程中经常发现有些申报企业在设置该参考品时只是选择一个临床的强阳性样本，然后进行倍比稀释，对系列稀释的参考品进行检测，直至检测到结果为阴性的参考品，并将上一个稀释度参考品设置为最低检出限的评价标准，或将该参考品的稀释度设定为评价标准。但是其并不能清楚的确定参考品中的被测物的具体浓度。因此，这种设置并不能有效的评价产品的最低检出限，也不能使不同批次的参考品保持一致性。所以应采用可能的方法对该参考品进行被测物的定量或半定量，以期给出最低检出限参考品中的被测物的具体量值。

【1】 定性检测用体外诊断试剂的企业内部参考品的设置

【2】 体外生物诊断试剂参考物质的现状与发展

【3】 人类白细胞抗原B27核酸检测国家参考品的建立

【4】 YY/T 1652-2019体外诊断试剂用质控物通用技术要求

【5】 登革病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则

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