诊断遗传性疾病：基因修复or替换？

40多年来，基因疗法一直都被大家看作是治疗基因缺陷遗传性疾病的手段之一。

基因疗法是基因发生突变的干细胞经过预处理之后进行基因替换治疗。用于替换细胞内突变基因的正常基因经由逆转录病毒载体进入细胞内，以半随机方式整合到细胞基因组内，表达正常的基因产物，行使该基因的正常功能。

基因修复疗法是人工核酸酶能够在突变基因位点处对DNA链进行切割，形成DNA链断裂切口。利用病毒为载体，将编码正常基因的DNA模板链导入经过预处理的细胞内。细胞会利用同源重组机制，以外源的正常DNA链为模板，完成基因修复工作，如图中白色虚线所示。Genovese等人优化了HSC细胞的预处理方案，使用二甲基前列腺素E2和SR1防止细胞早期分化，同时使用细胞因子降低细胞对核酸酶的敏感性，减少核酸酶对细胞的毒副作用。

最典型的基因治疗就是利用人工改造过的逆转录病毒载体（retroviral vector）往患者患病细胞的基因组中插入一个有功能的基因，代偿缺陷基因的功能，如图1a所示，即所谓的基因替换疗法。虽然已经利用这种添加外源基因的方法治疗过某些遗传性疾病，比如严重的联合免疫缺陷病（severe combined immunodeficiencies），并且取得过非常好的治疗效果，但是副作用也同样非常明显。因此有人提出了基因修复方案，Genovese等人将为我们带来基因修复技术的最新发展概况。

图1 基因疗法治疗遗传性疾病的两种治疗策略，a基因替换疗法，b基因修复疗法

基因修复技术主要依靠人工核酸酶（artificial nuclease enzymes）这种工具，这种核酸酶能够特异性的识别突变基因序列，并且将其切断，形成一个双链DNA断裂切口。此时如果添加一段正常的DNA序列，细胞就会以这段正常的DNA序列作为模板，利用同源重组修复机制（homologous recombination）对核酸酶造成的DNA断裂进行修复，得到一段正常的基因序列，完成对异常基因的修复工作，如图1b所示。这种基因修复方案的优势之一就是它完全利用了细胞自身的天然重组修复机制，对基因组内的其它区域，比如调控序列等区域完全没有影响。而前面提到的基因替换方案则主要依赖半随机的整合机制（semi-random integration method），这就有可能破坏遗传调控序列，因为这些外源序列有可能会非常不准确的插入到基因组中的其它位置上。从而导致一系列的毒副作用，比如因为载体介导的致癌基因活化等问题。

锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases）是一种在锌指蛋白（zinc-finger protein）上结合了一段人工DNA序列而成的人工核酸酶，它可以在这段人工DNA序列的指引下，将基因组中与其互补配对的核酸序列特异性地切开，这也是第一种人工设计出来专门用于基因修复工作，而且已经被试验证实，可适用于多种细胞系的酶。其它几种核酸酶，比如TALEN（经过人工改造的限制性核酸酶）或以细菌CRISPR系统为基础的RNA介导酶也都被用于多种人体细胞的基因修复工作当中，其中还包括诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）这种经过人工重编程之后能够分化出人体内绝大部分终末细胞的干细胞。Genovese等人已经利用这种技术对人造血干细胞（haematopoietic stem cells, HSC）进行了基因修复工作，HSC细胞是治疗血液系统遗传性疾病的关键治疗靶标。

那么Genovese等人是如何完成这项工作的呢？

我们知道进行基因修复最大的困难就是同源重组修复机制主要见于外周循环细胞（cycling cell），因为这些细胞大都处于细胞周期的S/G2期。因此对HSC细胞这种几乎全都处于休眠期（quiescent）的成体干细胞进行基因修复的成功率都非常低。不过Genovese等人用了几个小技巧，成功地将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）编码基因插入到了人HSC细胞基因组中特定的位点处，其中就包括X染色体连锁的严重联合免疫缺陷综合征（X-linked severe combined immunodeficiency syndrome, SCID-X1）患者IL2RG基因中发生突变的第5外显子位置。

Genoves等人的方法就是先用细胞因子（cytokines）这种信号分子（signalling molecules）对HSC细胞处理两天，然后在第二天时再利用病毒载体导入重组模板。再用电穿孔方式对细胞进行破膜处理，最后加入锌指核酸酶对细胞DNA进行定向切割。最先加入细胞因子有可能会降低核酸酶对HSC细胞的毒副作用，不过更重要的作用在于，这些细胞因子可以让部分HSC细胞脱离静息期，重新进入细胞周期，从而激活细胞的同源重组修复机制。另外，Genovese等人还使用了另外两种化合物，那就是二甲基前列腺素E2（dimethyl prostaglandin E2，dmPGE2）和芳香烃受体蛋白（aryl-hydrocarbon receptor protein）抑制剂SR1，这两种化合物都可以阻止HSC细胞过早的分化，帮助HSC细胞保持在干细胞状态下。

Genovese等人利用这套操作方法成功地对一些HSC细胞进行了基因组定点编辑（site-specific genome editing）操作。将这些处理过的HSC细胞植入免疫缺陷小鼠体内之后，在长达18周的时间内都可以检测到这些细胞，而且取自这些小鼠体内的这种人工HSC细胞还可以被移植到另外一只小鼠体内，继续发挥作用。后来Genovese等人又对一名SCID-X1患者的HSC细胞进行了基因修复操作，结果有3~11%的血液祖细胞，以及这些细胞分化出的骨髓细胞（myeloid cell）的基因得到了修复。

Genovese等人开展的这项工作毫无疑问将基因治疗技术又向前推进了一大步。我们知道，彻底治愈SCID-X1疾病只需要很少一些IL2RG基因得到修复的HSC细胞就足够了，因此Genovese等人开发的这套技术完全可以治疗SCID-X1疾病。但是在这套技术的临床效果得到验证之前，我们首先得对它的安全性进行一番评估，看看这套试验操作对细胞DNA带来有害突变（细胞借助容易出错的、非同源重组修复机制对非目标DNA断裂进行修复所造成的DNA改变）的几率有多高。不过令人欣慰的是，Genovese等人在实验过程中并没有观察到太多的脱靶效应。

如果将这种HSC细胞基因修复技术用于治疗比SCID-X1疾病的基因修复水平要求更高一个等级的疾病，比如Wiskott–Aldrich综合症（Wiskott–Aldrich syndrome）、脑白质肾上腺萎缩症（adrenoleukodystrophy）、异染性脑白质营养不良（metachromatic leukodystrophy）或β地中海贫血（β-thalassaemia）等疾病，我们还需要对该技术进行进一步优化。比如设计出DNA切割保真度更高的核酸酶；在植入体内之前，先对修复过的HSC细胞进行体外培养扩增，提高成功率等。值得指出的是，在经过优化的基因替换试验操作方案中也会用到自我抑制（self-inactivating）的病毒载体，这是为了减少（宿主）细胞基因、包括癌基因的活化，这种方法已经被试验证明是安全，而且非常有效的。所以究竟应该进行基因替换，还是基因修复，这个问题还会一直讨论下去。

对于HSC细胞这种取自病变组织的干细胞，基因修复技术也许会是一个更好的选择。随着细胞重编程技术（reprogramming）的不断进步，对这些源自患者自身的iPCS细胞或诱导HSC细胞进行基因修复可能会成为一种比较成功的临床治疗手段。不过在这一天到来之前，我们也很乐于看到Genovese等人取得更多、更大的技术突破。