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新一轮分子诊断技术革命!CRISPR/Cas实现快速精准检测!

2020-10-29 00:00| 编辑: 归去来兮| 查看: 6216| 评论: 0|来源: 小桔灯网 | 作者:卷毛沸沸

摘要: 近三年无疑是基因编辑技术最火热的时期,并在今年捧走了万众瞩目的诺贝尔将被其中以CRISPR/Cas9(即利用细菌特有的免疫系统一种名为Cas9的酶对目标细胞DNA序列进行修改,实现对由基因缺陷所引起的疾病的有效 ...


图丨网络

近三年无疑是基因编辑技术最火热的时期,并在今年捧走了万众瞩目的诺贝尔将被其中以CRISPR/Cas9(即利用细菌特有的免疫系统一种名为Cas9的酶对目标细胞DNA序列进行修改,实现对由基因缺陷所引起的疾病的有效治疗)为代表的基因组编辑技术在生物医学等诸多领域产生了深远影响。


殊不知,CRISPR技术不仅对于临床治疗产生颠覆性革新而是正以更猛烈的速度冲击突破IVD领域那些未被解决的关键问题!


一位IVD业内资深人士表示:“基因编辑CRISPR技术打破了传统分子诊断技术的局限性,正在创造出低成本、高灵敏性、高特异性的分子诊断技术。它在IVD领域的运用意味着终端医院操作更加简单、应用更为普及,并为临床诊断的一切开源,高度适配『去中心化』的检测需求。”

基因编辑CRISPR技术赋能分子诊断


基因编辑又称基因组工程,是遗传工程的一种, 是指在活体基因组中进行DNA插入、删除、修改或替换的一项技术。被认为是未来有希望治疗癌症/预防的重要手段之一。要准确理解基因编辑CRISPR技术在体外诊断领域工作的意义,我们有必要简单回顾CRISPR Cas9。


图丨网络


相信大家都了解,基因组稳定性是细胞维持自稳平衡、精确调控增增殖、分化、死亡程序的遗传学基础。现代环境中各种物理的、化学的以及机体自身代谢生成的基因毒,均有可能引发DN双链断裂等多样态的基因结构损伤,这种损伤将为基因组带来不稳定和突变,从发引发癌症标志物的出现,或在已患癌群体中提升肿瘤细胞的生存能力,增加癌症细胞在正常细胞传播的可能性。


CRISPR技术与酵素Cas-9(即CRISPCas9技术)的接合就是从入侵的病毒基因组中找出序列吻合的片段,并通过信号标记切断精确位置,病毒暨遭到分解、无法在复制。利用CRISPR技术科学家可以修改并编辑任何基因组。快速、便捷、便宜又有效。


其中,核酸剪切酶Cas-9是这场医学变革技术中不可缺少的元件,他能够以针对具有特异性DNA序列的DNA进行双链剪切。然而CRISPR-Cas9缺乏切割单链核酸的酶活结构域,无法用于体外检测。


在学界对基因编辑CRISPR Cas-9 刚有初步认识的时候,就有科学家提出疑问:既然CRISPR Cas-9 成功应用于哺乳动物和人类细胞的基因编辑,那体外诊断行业也是否也能应用CRISPR技术?


答案是肯定的,根据研究得出CRISPR/Cas系统可以分为两类:第一类系统的核酸酶由多个亚基组成;第二类系统特别受关注,其核酸酶由单一的蛋白组成,包括基于Cas9、Cas12和Cas13效应蛋白的II、V和VI型,其第二类Cas系统非常适配于IVD行业的分子诊断。

CRISPR的不同剪切酶攻克肿瘤、遗传病等诊断难题


年初的新冠大流行告诉我们,快速且易获取的检测方法对于实现有效的公共卫生响应很重要。然而,目前的新冠病毒检测方法往往需要几小时甚至几天才能出结果。无疑,实时定量PCR和逆转录(RT-qPCR)测量病毒RNA的数量,仍然是目前SARS-CoV-2病毒检测的金标准技术。但是,无法获得RT-qPCR仪器,试剂和训练有素的仪器操作员,可能会限制该诊断工具的实用性,并会限制突发疫情的检测效率与场景,尤其是在资源有限的发展中国家。


新发现的Cas12/Cas13/Cas14内切酶不同于Cas9,它们使得CRISPR系统在病原体的快速诊断和肿瘤基因检测领域的应用成为可能,对肿瘤基因或特定病原体、遗传病可以实现实现低廉、精准、高效的检测。


图丨对于CRISPR诊断非常重要的Cas12,Cas13和Cas14属性


Cas12/13/14在体外诊断的重要意义在于:它们普遍存在酶活性结构域,当蛋白正确结合到靶向序列时,能够激活这一结构域,切割探针小分子,实现从待检序列信息到荧光信号的转化。基于它们的这一特点,在医学检测领域需要靶向检测已知序列的情况下,能够实现普通实时定量PCR所无法达到的灵敏度,摆脱对实时定量PCR仪的依赖。


  • Cas 12:基于其产生靶向双链DNA(dsDNA)断裂的能力而被用于基因组编辑。Cas12酶家族在gRNA的引导下与目标序列结合以后,便会切换为激活状态,疯狂的切割体系内其它的单链DNA。Cas12a这一特点可被用于分子诊断领域,实现对肿瘤基因或特定病原体的检测。


  • Cas13:基于细菌免疫系统的RNA裂解和编辑系统,可保护其垂直病毒侵袭。该系统称为CRISPR-Cas9系统,但与DNA的Cas9不同,Cas13蛋白仅切割单链。


  • Cas14:蛋白结合并切割用户指定的单链或双链DNA。为了检测RNA,必须将基于Cas14的诊断程序与将RNA转换为DNA的蛋白质结合起来。切割ssDNA时,Cas14蛋白没有靶向限制。它们用途广泛。对于dsDNA靶向,Cas14蛋白需要富含T的PAM序列(如TTTA)

接下来,我们用基因编辑CRISPR技术领域先驱研究结果来进行论证。


论文频登《Nature》

CRISPR/Cas补足RT-PCR短板!


今年2月,由詹妮弗·杜德纳实验室(Jennifer Doudna s lab)成员成立的CRISPR诊断公司猛犸生物科学公司(Mammoth Biosciences)发表了一份白皮书,描述了该公司利用诊断检测技术在大约30分钟内检测出SARS-CoV-2 RNA的情况。

图丨Mammoth Biosciences


猛犸象公司基于CRISPR-Cas12的侧向流动测定法,在《Nature》发表文章。CRISPR-Cas12相比具有与qRT-PCR测试相同的敏感性和特异性,具有95%的阳性预测一致性和100%的阴性预测一致性。

图丨Nature (用于检测SARS-CoV-2的DETECTR(RT-LAMP / Cas12)分析与CDC qRT-PCR分析的比较)


这种结果意义在于,此前的 RT-PCR 的检测一般要等几个小时,还需要使用特殊设备、进行冷热循环;与之相比,最新基于 CRISPR 的方法只有两个固定的操作温度,大约30- 40 分钟后,就能像家用验孕测试一样,在可视化读出条上读取结果。


无独有偶,8月26日,张锋和他的前团队成员Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg发表了一份新冠病毒简称方案,研究表示CRISPR Cas13技术应用至sherlock平台,能利用在短短60分钟内检测出RNA病毒。它的工作原理使其能够锁定特定的基因序列,在鼻、口、喉拭子或肺部液体中检测SARS-CoV-2基因物质的片段。如果发现病毒的遗传物质,CRISPR酶就会发出荧光。

图丨SARS-CoV-2 RNA的SHERLOCK检测


图中显示:SARS-CoV-2 RNA区域通过RT-RPA等温扩增为DNA,然后通过T7噬菌体转录转化为RNA。Cas13a-crRNA复合物与扩增的RNA靶标的同源结合触发Cas13a的附带活性,从而切割RNA报道分子。切开的RNA报道分子可在比色侧流条上捕获(生物素-荧光素RNA报道分子,顶部路径),或通过荧光信号可视化(分子信标荧光报道分子,底部路径)。

图丨张锋团队基于Cas13的检测SARS-CoV-2 RNA的检测方法的临床验证


与杜德娜团队的研究结论不同的是,与RT–qPCR相比,我们发现基于SHERLOCK的临床样本中SARS-CoV-2 S基因检测的荧光读数灵敏度为96%,特异性为100%,而侧向荧光检测灵敏度为88%,灵敏度为100%流量读数,这表明在这项实验中基于SHERLOCK平台CRISPR Cas13检测结果灵敏度低于RT-PCR。


综合设计位置/剪切位置、病毒自身的特异性多方面因素来说,这项技术的灵敏度还有待于优化(不过世界没有任何一项技术是100%稳定的)。


同一时间,猛犸象基于CRISPR-Cas12的侧向流动测定法的灵敏度也质疑低于RT-PCR检测。

猛犸象生物首席技术官Janice Chen博士表示:“我们仍在努力了解病毒载量与结果之间的关系,值得一说的是我们的测定速度更快,可视读数更好,成本更低。”


根据最新消息,Broad研究所的著名学者张锋教授和合作伙伴一起改善基于CRISPR技术的新冠病毒简易检测流程,这一流程被称为STOPCovid.V2。20.版本的2.0版的STOPCovid在原有检测的基础上更进一步在样本制备的过程中通过加入磁珠富集样本中的RNA,从而通过提高PCR反应的起始RNA数量,进一步提高了STOPCovid.V2的检测灵敏度。


小编个人认为:快速准确地识别传染病对于优感染控制和公共卫生干预至关重要。全球公认理想的诊断产品是测试价格低廉,准确,并能迅速提供结果,可在多种样本类型上进行即时使用,无需专业技术人员,辅助设备或电源。 CRISPR就有很多这方面的优势:灵活性(对不同的基因靶点只需改变gRNA序列)、高特异性、便捷性、可模块化、可编程、低成本等 。参照张峰的sherlock 平台,若合成生物学进展够快,CRISPR系统技术的确可以快速、准确的出具分子诊断结果,并转化为POCT分子检测。


国内外CRISPR诊断技术企业现状与未来!


分子诊断在应用CRISPR新技术时,整个市场也在期待是否会带来一场新的变革。


据美国咨询公司 Markets and Markets发布 的 CRISPR技术市场分析报告,目前,CRISPR技术主要应用在科研、农业和生物医学等方面 。


  • 生物医学应用将成为未来五年内增长最快的部分 ,而基因治疗、药物发现和诊断方面的发展将推动生物医学领域的增长。


  •  2017 —2023年期间CRISPR技术的市场规模在2017年为5.46亿美元 ,到 2023年将增长至39亿美元 , 其复合年增长率( CAGR)将达 44 %;CRISPR体外诊断 市场规模预计自 2020年开始将呈现快速增长的态势。

如今,中外 CRISPR诊断技术公司不相伯仲,基本处于同一起跑线,当前世界上还未形成绝对成熟,以及CRISPR技术诊断领域的龙头企业,商业化和产业化正在处于不断探索之中。


目前,CRISPR技术全球市场的主要参与者有:国际市场Mammoth Biosciences、Sherlock Biosciences、Caribou Biosciences等;国内市场有南京吐露港生物、杭州杰毅生物、南京金斯瑞生物、深圳微远基因、苏州克睿基因等。


☞ 1、 Mammoth Bioscience


今年诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna在2017年创立了Mammoth Biosciences,该公司利用CRISPR技术完成传染病、肿瘤学和基因突变方面的快速诊断 。

2020年初,Mammoth Biosciences获得4500万美元B轮融资,Plum Alley、NFX、德诚资本、aMoon Fund、Mayfield Fund投资。早前公司曾从 NFX手中获得过12万美元的投资 ;2018年8月获得了由Mayfield领投,NFX、8VC、 苹果 CEO蒂姆·库克和早期癌症筛查公司Grail前首席执行官Jeff Huber 参投的 2300万美元A轮融资 。


2、Sherlock Biosciences ☜


公司于 2019年张锋 参与 成立,核心技术由麻省理工学院和哈佛大学授权,分别是基于基因编辑技术 CRISPR的诊断技术平台SHERLOCK,和基于合成生物学的分子诊断平台INSPECTR。公司基于CRISPR技术完成快速诊断,可以检测多种生物或样本类型的遗传基因,直至达到个位数的阿摩尔级 。

2019年获得了由Northpond Ventures和BV百度风投领投的3500万美元的融资之后,又接连获得了DTRA以及比尔及梅琳达·盖茨基金会的两笔额外资助。这些资金将有助于该公司推进旗下的两个技术平台SHERLOCK和INSPECTR的开发,为新诊断场景打下坚实基础,以实现各种通用场景的诊断。


☞  3、Caribou Biosciences


Caribou Biosciences是由CRISPR-Cas9生物学的先驱Jennifer Doudna创立的领先临床阶段CRISPR基因组编辑生物技术公司。该公司正在开发一条现成的CAR-T细胞疗法和基因组编辑的自然杀伤(NK)细胞疗法的内部管道。


4、杭州杰毅生物☜


杭州杰毅生物成立于 2019年,是一家专注基因检测,以分子技术为平台的高新技术企业,致力于为客户提供感染性疾病分子诊断的整体解决方案。绕基因编辑(CRISPR/Cas)和高通量测序(NGS)两大前沿技术路线,专注打造新一代分子诊断平台。

2020年3月 完成由比邻星创投、普华资本和体外诊断资深产业人士等联合投资 的 近亿元人民币 Pre-A轮融资。随后,8月获得辰德资本千万级别投资,正式完成A轮融资。此前杰毅生物已获得由比邻星创投、普华资本和体外诊断资深产业人士等联合的Pre-A轮投资。


☞5、南京吐露港生物:


吐露港生物由来自中科院合成生物学重点实验室的顶尖学术团队和来自分子诊断行业的资深产业人士创立,公司在2017年开发了基于CRISPR/Cas12系统的创新核酸检测技术,并将其命名为“HOLMES”,相比于传统恒温检测、qPCR、NGS等分子诊断技术,HOLMES核酸快检技术具备高灵敏、高特异、快速等优势。


今年8月,该公司已顺利完成数千万元融资,此轮融资将主要用于公司CRISPR诊断底层方法学专利——HOLMES技术的体外诊断产品开发与注册。



6、克睿基因☜


苏州克睿基因成立于 2016年,是一家由CRISPR基因编辑技术应用的先驱者联合创办的转化型生物科技企业 , 专注于新型医药、分子诊断领域中 CRISPR技术原创性应用的开发,致力于解决难治愈性肿瘤、复杂遗传性疾病的临床需求。



☞7、 深圳微远基因


公司成立于 2018年, 专注于基因科技与精准医疗方向 ,拥有两大核心技术平台,包括基因编辑技术 (CRISPR)的快速诊断平台与二代高通量测序(NGS)平台。2019年9月完成由火山石资本、国科嘉和基金共同领投的数亿元A轮融资。


8南京金斯瑞生物☜


金斯瑞拥有CRISPR/Cas9基因编辑系统相关的多种高质量产品,包括质粒,蛋白,RNA等。金斯瑞长达140nt的RNA化学合成能力,可替代传统质粒转录sgRNA、IVT sgRNA,为T细胞编辑提供编辑效率高、毒性低、批次间稳定的选择。


END


一项技术,要想能广泛的应用,其必须是便宜而稳定的。CRISPR/CAS系统在IVD领域的革命性正在与此,不需要复杂的实验设备,不需要投入大量的时间,更不需要很多经费。未来,我们期待CRISPR/CAS技术为分子诊断带来的曙光。

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