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等温扩增技术LAMP和CPA的“孪生兄弟相”

2020-10-16| 编辑: 归去来兮| 查看: 288| 评论: 0|来源: IVD学习笔记 | 作者:iAnny

摘要: 想了很久,还是决定将LAMP和CPA放在一起进行介绍。主要是因为两者的引物设计都相对比较复杂,但却有着比较相似的工作原理,有异曲同工之妙。背景:LAMP,loop-mediatedisothermal amplification,环介导等温扩增技术 ...


想了很久,还是决定将LAMP和CPA放在一起进行介绍。主要是因为两者的引物设计都相对比较复杂,但却有着比较相似的工作原理,有异曲同工之妙。

 
背景:

LAMP,loop-mediatedisothermal amplification,环介导等温扩增技术
LAMP是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术,它针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物(包括2条内引物和2条外引物),利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶,在65℃条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列,
 
CPA,CrossingPriming Amplification,交叉引物扩增技术
CPA是2008年由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术,也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。它针对目的基因4或5个区域设计4或者5条特异性引物,利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、甜菜碱,在63 ℃左右条件下进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。

根据交叉引物数量的不同,CPA可分为双交叉扩增(共4条引物=2条交叉引物+2条剥离引物)和单交叉扩增(共5条引物=1条交叉引物+2条剥离引物+2条普通引物)。



LAMP

设计:
  • 6个区域:F1-3, B1-3,其对应互补序列(complementary)F1c-3c,B1c-3c

    5’-F3-F2-F1-B1c-B2c-B3c-3’

    3’-F3c-F2c-F1c-B1-B2-B3-5’

  • 两个内引物FIP和BIP

         5’-F1c-F2-3’
         5’-B1c-B2-3’
  • 两个外引物

         F3和B3
反应原理:
1、上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合,引物上的F1c处于游离状态,Bst DNA聚合酶的作用延伸合成带有FIP引物特定序列的互补链;
2、外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出新合成的带有FIP引物特定序列的互补链;
3、FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构,自我碱基配对形成环状结构,即形成单哑铃状结构模板;
4、以此链为模板,下游引物BIP和B3,以上一步骤中形成单哑铃状结构的单链为模板启动反向新链的合成。
5、同样的,新合成的单链中B1和B1c互补形成另一端的哑铃状结构;这样就形成的两端为环状的哑铃型单链DNA模板结构;
5、哑铃型单链DNA模板结构(包括以上步骤中形成的单哑铃状单链DNA),既可以以自身为模板进行扩增,同时也可以作为引物进行目标靶序列的扩增;
6、请记住,只要有游离的3’端存在,就有延伸的可能性。

LAMP原理图
来源:Chukwunonso O. Nzelu, et al. PLOS Neglected Tropical Diseases,November 7, 2019

CPA

CPA-单交叉引物
设计:
  • 5个区域:

    5’-4s-1s-2s-3s-5s-3’

    3’-4a-1a-2a-3a-5a-5’

  • 1个交叉引物

    5’-2a-1s-3’

  • 2个剥离引物

    4s和5a

  • 2个探针引物

    2a和3a


反应原理:
1、交叉引物的1s同目标序列1a互补进行新链合成;
2、由于交叉引物5‘端的2a游离,会被剥离引物4s在Bst DNA聚合酶作用下进行链置换;
3、新合成的带有交叉引物序列的新链就被置换出来;
4、探针引物2a和3a以新置换出来的DNA单链为模板继续合成新的模板链,由于5a的存在,可以将以2a和3a为引物合成的新DNA模板进行置换,从而形成多个DNA单链模板,同时也可以作为因为引物存在;
5、另外,有交叉引物存在,会在同一单链DNA中引入互补序列2a和2s,从而系统中会存在1+3单链的发夹结构;发夹结构可以在交叉引物存在条件下进行扩增,也可以以2a和3a为引物进行扩增;
6、总之,整个反应放大后,或产生2种不同的长度的终产物,即2+1+3+2和2+1+3。

 CPA单交叉引物原理图
来源:Gaolian Xu, et al. SCIENTIFIC REPORTS | 2 : 246 | DOI: 10.1038/srep00246

CPA-双交叉引物
设计:
  • 4个区域:

    5’-3s-1s-2s-4s-3’

    3’-3a-1a-2a-4a-5’

  • 2个交叉引物:

    5’-2a-1s-3’

    5’-1s-2a-3’

  • 2个剥离引物:

    3s和4a


反应原理:
1、正反向交叉引物识别模板进行新链合成;
2、剥离引物3s和4a,同样在Bst DNA聚合酶作用下进行链置换,将利用交叉引物合成的新模板置换出来;
3、两条交叉引物识别带有交叉引物序列的模板进行扩增,这样,模板就会不同重复的被延长带有交叉引物的序列;
4、 在同一时间内,可以同时启动多组DNA合成和链置换过程。

CPA双交叉引物原理图 图片来源:网络
 
小结:LAMP和CPA的异同点

1、两个系统的引物设计都比较复杂,公认的烧脑;
2、两个系统都可以通过内引物(LAMP)和交叉引物(CPA)实现模板的增长;
3、两个系统都使用外围引物(LAMP的外部引物和CPA的剥离引物)在BstDNA聚合酶下进行链置换过程;
4、不同点在于引物设计针对的序列排序,导至最终形成哑铃结还是发夹结构+短的DNA模板。

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