CRISPR基因编辑遭遇重大危机，Cas9蛋白本身有潜在致癌性，能够促进p53突变富集

导读：5月18日，Broad研究所 Uri Ben-David 团队在 Nature Genetics 杂志发表论文，证实Cas9本身能够激活多种细胞系中的p53通路，并促进p53失活型突变的选择性富集。进一步表明了Cas9蛋白本身具有潜在致癌性，给基于CRISPR/Cas9基因编辑的临床治疗带来新的疑问。

1953年，沃森、克里克等发现了DNA双螺旋结构，人类自此开启了分子生物学时代，在此后短短的几十年里，美丽而又复杂的生命之迷被人类快速破解。

2013年，CRISPR/Cas9基因编辑技术诞生，人类开始进入一个新的时代，在这个时代里，人类得以快速精准地操纵基因、改变生命，攻克癌症、摆脱遗传病...曾经那些遥不可及的梦想从此变得触手可及。

CRISPR/Cas9是一个优美的工具，然而，这个工具绝非完美，自诞生时起，CRISPR/Cas9就伴随着脱靶性的担忧。实际上，随着基因编辑技术的优化，脱靶性已不是Cas9面临的最大问题，而更多的风险因素逐渐开始暴露。

Cas9基因编辑的潜在致癌性

2018年6月12号，Nature Medicine 杂志背靠背发表了两篇来自瑞典卡罗琳斯卡学院和诺华生物医学研究所的研究论文。

这两篇论文均表明，CRISPR/Cas9系统能够激活p53引起的DNA损伤，p53是最著名的抑癌基因，p53会判断DNA变异程度，如果变异较小，就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，就诱导细胞凋亡。

正常的p53基因会抑制CRISPR/Cas9基因编辑，也就是筛选到的成功被编辑的细胞，p53基因很可能有缺陷，细胞癌变风险提高，如果将通过CRISPR/Cas9基因编辑的细胞用于治疗，将会有潜在致癌性风险。

CRISPR/Cas9破环染色体稳定性

2018年8月8日，澳大利亚阿德莱德大学 Paul Q. Thomas 等人在 Nature 发表了题为：Large deletions induced by Cas9 cleavage 的研究论文，发现CRISPR/Cas9基因编辑后的小鼠受精卵中出现频繁的大量碱基缺失（千碱基量级）。

2019年3月8日，法国波尔多大学的研究人员在 Nature Communications 杂志发表题为：CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations  的研究论文。

该研究发现CRISPR/Cas9基因组编辑会诱导出现百万碱基规模的染色体大片段缺失。这么大长度的片段缺失，比脱靶效应更为严重，该研究中双链断裂造成的染色体截短，直接造成了43个基因的丢失，这43个基因中，5个是原癌基因，7个是抑癌基因，令人震惊的是，这7个抑癌基因中有5个是抑制白血病的抑癌基因。这些抑癌基因的丢失，很可能会导至细胞癌变。

这项研究也揭示了CRISPR/Cas9诱导的DNA双链断裂（DSB）对人类细胞基因组的全局性破坏作用。

人体对Cas9蛋白存在免疫反应

2019年1月28日，斯坦福大学的研究人员在 Nature Medicine 杂志发表题为：Identification of Pre-Existing Adaptive Immunity to Cas9 Proteins in Humans 的论文。该论文证实人体预先存在针对Cas9蛋白的免疫应答。

虽然多种Cas9同源物已经被鉴定，但是最完善的系统来源于金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌。金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）主要用于体内编辑，因为它可以更容易地包装到AAV载体中。临床前研究显示酿脓链球菌Cas9（SpCas9）在体外和体内具有巨大的治疗潜力。

而金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌是常见的人类共生体，也是致病性病原体，许多人曾感染过这两种病菌，研究人员发现，在人血清中可以检测到SaCas9和SpCas9的IgG抗体，而许多健康人类具有针对SaCas9的预先存在的抗原特异性T细胞。

这项研究表明，人类对Cas9蛋白预先存在的适应性免疫应答很可能会妨碍CRISPR/Cas9系统安全有效地用于治疗疾病，甚至可能对患者产生显著的毒性。

Cas9蛋白促进p53突变富集

2020年5月18日，Broad研究所 Uri Ben-David 团队在 Nature Genetics 杂志发表了题为：Cas9 activates the p53 pathway and selects for p53-inactivating mutations 的研究论文。

该研究发现，在没有外源sgRNA的情况下，Cas9蛋白的过表达能够激活多种细胞系中的p53通路，并促进p53失活型突变的选择性富集。

Cas9过表达对细胞的影响

研究还发现，Cas9在p53正常的细胞系中的活性远低于p53突变细胞系，并且Cas9诱导的p53途径激活影响细胞对遗传和化学筛选的敏感性，进而影响筛选结果。

结语

基因编辑在临床应用最基础的要求就是准确性与安全性。作为涉及DNA层面的遗传操作，基因编辑的副作用对病人造成的伤害无疑是可怕的，因此基因编辑技术进入临床使用需要慎之又慎。

对于准确性来说，CRISPR/Cas9基因编辑技术自诞生以来，脱靶效应始终令人担忧，脱靶性通常是由于对DNA的错误切割造成的，除了提高CRISPR系统靶向的精准性以外，开发DNA切割活性丧失的dCas9，以及不依赖DNA双链断裂的单碱基编辑器也重要的方向。

对于安全性来说，人体对细菌来源的Cas9蛋白的免疫原性反反应，CRISPR/Cas9激活p53引起的DNA损伤，引起染色体大片段缺失，以及引起p53失活突变的富集等等，都是CRISPR/Cas9在人体上应用的巨大障碍。

近几年，CRISPR/Cas9基因编辑临床试验陆续开展，一些临床试验也展现了良好的效果，且短时间内未观察到明显的安全风险。这表明，CRISPR/Cas9基因编辑在人体上的应用已没有不可逾越的障碍，我们需要做的就是解决这些已发现的问题，为发展出安全和有效的人类基因编辑临床应用方案而努力。