CRISPR技术正当红，我们来科普一下

壹 CRISPR体外诊断技术概况

1、CRISPR技术的定义

CRISPR的全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），Cas的全称则是CRISPR associated（CRISPR关联），合在一起简称为CRISPR/Cas系统。Cas9（CRISPRassociated nuclease）是CRISPR相关核酸酶，CCRISPR/Cas9是最一种由RNA指导，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。该技术是被人们发现并加以利用，而非为人类开发合成的。

CRISPR/Cas9成功与否的关键在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提高基因组编辑的准确性，对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas9只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割，可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶效应。

2、CRISPR技术原理

CRISPR/Cas9主要由两部分组成：gRNA和Cas9蛋白。gRNA由CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA（trans-activating crRNA,tracrRNA）组成，crRNA的一部分序列能与tracrRNA配对，形成双链RNA结构；一部分序列与靶目标互补区域，以此识别靶序列。Cas9蛋白先与gRNA形成复合体（Cas9-sgRNA），使Cas9蛋白构象变化，产生一条通道，使其更容易与DNA结合。该复合体随机碰撞DNA，若未识别到PAM序列，则会快速离开DNA，发生下一次碰撞；若识别PAM序列，Cas9蛋白的Arg1333和Arg1335会与二核苷酸鸟嘌呤结合，此时，Ser1109和Lsy1107形成磷酸锁结构，与PAM序列旁的+1位核苷酸发生相互作用，促使双链DNA解旋，利用RNA-DNA碱基互补配对原则，核对序列与crRNA的互补情况，若在种子序列出现较多错配，则序列识别过程终止，从而确保Cas9在正确的目标处发挥作用。

从原理上来说，CRISPR分子诊断方法实际上是将扩增方法与Cas蛋白的检测相结合。CRISPR检测在提高灵敏度的同时，也提高了特异性，而且降低了对仪器依赖。另外，经过方法优化，CRISPR检测也做到了多靶标、一步法定量检测、DNA和RNA相同步骤检测和适合野外偏远地区的快速分子检测。

3、CRISPR体外诊断技术发展历史

CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的，并在7年后首次用于生物化学实验，迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域最流行的基因编辑工具。 

在2015年初，中国科学院深圳先进技术研究院周文华团队提出：CRISPR体系在分子诊断领域将有巨大的应用前景和优势，其因此也作为世界范围内最早提出这一设想的课题组之一。

但CRISPR体外诊断技术的发展不得不追溯到加州大学（伯克利）的Jennifer Doudna博士、麻省理工张锋博士，二者不但在CRISPR诊断技术的发明、应用上做出奠基性的贡献，还积极致力于该技术的产业化和商业化。

2016年8月张锋团队在Science期刊上发表了的一篇关于一种新CRISPR核酸酶的文章C2C2（即俗称的Cas13a）。他们意外发现Cas13a在完成特异性切割RNA之后，能够非特异性的切割任意的单链RNA，Cas13a具有强烈的细胞毒性。

就在张锋进行Cas13a的研究的同时，UC-Berkeley大学的Doudna团队也在进行相同的研究。于同年10在月Nature上发表研究结果——Cas13a非特异性切割RNA能够用于核酸的分子检测。

此后，张锋团队加速了Cas13a在核酸检测上的研究，于2017年4月在Science期刊上发表研究成果——一个基于CRISPR/Cas13a的分子诊断技术（简称SHERLOCK）。

2018年2月，Doudna团队在Science期刊上发表研究成果——除Cas13a具有非特异性切割RNA的功能，Cas12a与Cas13a具有相似的特性，在特异性的切割目的DNA之后，能够非特异性的切割单链DNA。并基于此发明了基于Cas12a的分子诊断技术（简称DETECTR）。原理同Cas13a一样，不过用于发光的底物是单链DNA。

2018年4月，中国科学院上海生命科学研究院王金团队在Cell Discovery期刊上发表了基于Cas12a的分子诊断技术。

2018年9月，中国科学院深圳先进技术研究院周文华团队在Nature Communications期刊上发表了研究成果——利用CRISPR系统效应蛋白Cas9在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化，高效启动针对靶核酸分子指数倍扩增的分子诊断技术（简称CRISDA）。

2018年10月，Jennifer Doudna团队LucasHarrington发现Cas14a的切割对象是单链DNA，而不是双链DNA，因而Cas14a可用在DETECTR诊断工具中。Cas12a擅长识别双链DNA，Cas13a擅长识别单链RNA，Cas14a擅长识别单链DNA，因而RNA、双链DNA和单链DNA都可以检测。通过比较Cas12a和Cas14a检测单核苷酸多态性（SNP）的能力，发现Cas14a的特异性增加可实现高保真的SNP基因分型。

4、CRISPR诊断技术优势

同其它基因编辑技术相比，CRISPR有很多优势：灵活性（对不同的基因靶点只需改变gRNA序列）、高特异性、便捷性、可模块化、可编程、低成本等等，因此该技术正在医疗、农业和工业等多个领域被广泛开发。在医疗领域中，CRISPR技术的应用也主要有三个方向：治疗、科研工具、体外诊断（IVD）。

在体外诊断领域中，CRISPR技术在诸多方面均优于传统PCR技术：

5、CRISPR体外诊断技术应用领域

就CRISPR技术在IVD领域来看：CRISPR诊断特异性极好，可以检测到一个碱基的突变，非常适合早期筛查肿瘤、检测肿瘤易感基因和致病基因；

同时，CRISPR诊断技术操作简单、对仪器设备依赖性低、价格低廉，适合野外检测和不发达地区检测；例如国内某兽医科研单位基于CRISPR建立适合养殖场净化的诊断方法，刚果民主共和国利用CRISPR分子诊断技术检测埃博拉病毒（Ebola virus）；