新型荧光标记物量子点的标记方法、优点和不足介绍

由于量子限制效应，量子点的电子及光学特性具有独特的粒径依赖性。目前很多学者已系统研究了不同大小、形状及组成成分的量子点，这些基础理论广泛应用于太阳能电池、光电子晶体管、荧光生物标记等领域 。

量子点是由硒化镉（CdSe）、碲化镉（CdTe）、硫化镉（CdS）、硒化锌（ZnSe）、磷化铟（InP）或砷化铟（InAs），或是CdSe核上包裹一层ZnS或CdS组成的纳米晶或半导体纳米晶。当半导体材料吸收1个含有能量大于其频带间隙的光子时，1个电子则从价电子带激发到传导带，留下1个带正电荷的空穴，形成电子-空穴对，1个电子-空穴对叫作1个激发子。激发子就像人工原子，半径在1～10nm，其大小依赖于半导体的性质。由于半导体晶体大小和激发子的大小相似，因此强烈的量子限制效应改变了激发子特性，随着晶体大小的减小，激发子的运行更像一个盒中粒子。其能量水平主要是由粒子（盒子）的大小决定，而非由整块半导体的性质决定。这种在三维空间表现出强烈的量子限制效应的半导体纳米晶被称为量子点。电子和空穴结合产生光，光波的长度主要通过测定量子点的大小来确定，现有的技术可以制备出大小特别均一的量子点，且其产生的光波带宽度在10～50nm 。

量子点的标记方法

量子点可以与特定抗体或小分子结合，在不改变其化学特性的情况下，受到光源激发后可发出特定波长的荧光，实现对靶标的识别及检测。量子点与生物大分子如核酸、蛋白质、养分载体等之间的结合，通常有以下几种方法：静电吸引法、常规交联剂连接法及生物素-亲和素法等 。

（一）静电吸引法

正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，产生静电吸引。巯基乙酸修饰的量子点表面带负电，与带正电的蛋白质表面区域可通过静电吸引连接起来，而不需要其他试剂。对于带中性电荷的蛋白质，可以通过改造蛋白质在其末端构建带正电荷的结构，使其能静电吸附于量子点表面。另外，通过对量子点表面修饰使其带负电荷后，除了上述的直接静电吸引靶标物质外，还可以静电吸附连接上亲和素，然后依靠生物素-亲和素的高特异性结合，间接将量子点连接到蛋白质分子上。这种连接降低了量子点的表面缺陷，增加了量子点的荧光强度。不过当蛋白质的比例过大时，蛋白质之间产生交叉结合使部分量子点聚积，从而降低了量子点荧光强度。因此，控制量子点与靶标蛋白的比例对检测灵敏度至关重要。

（二）常规交联剂连接法

交联剂是一类小分子化合物，相对分子质量一般在200～600u，具有两个或者更多的针对特殊基团（如氨基、巯基等）的反应性末端，可以和两个或者更多的分子偶联从而使这些分子结合在一起。常用的交联剂有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、N，N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、戊二醛、二异氰酸化合物和二卤化二硝基苯。利用这些交联剂可以使量子点上修饰的羧基与小分子物质的氨基通过缩合作用进行偶联标记。已有人利用EDC及NHS交联方法，将1，3-二氨基-2-丙醇偶联到羧酸化量子点上，使其羟基化，减小了量子点尺寸（13～14nm直径）、增加了其荧光强度及在酸性或碱性环境下的稳定性，大大降低了量子点与细胞膜或蛋白质的非特异性结合（只有羧基化量子点的1/140）。经配体交换修饰的QDs用EDC和NHS法可以连接到成纤维细胞上，这种量子点可以穿透细胞膜，到达细胞核  。

（三）生物素-亲和素法

生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，BAS）是20世纪70年代后期迅速发展起来的一种新型生物反应放大系统，在生命科学研究领域有着广泛的应用。由于它具有生物素与亲和素之间的高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合起来，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。目前，将量子点与生物分子结合的最常用方法就是通过生物素-链（霉）亲和素系统结合，用于抗原抗体相互识别、活体标记及特异性标记，这种量子点探针灵敏度高、荧光信号强。

（四）其他标记方法

Feng等（2007）利用异源双功能交联剂琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧酸盐把量子点与抗体或配体的巯基通过缩合反应偶联到一起，用于毛细血管电泳法测定人IgM，效果良好。

量子点标记后，通常要分析鉴定标记物的质量，通常采用的方法有光谱分析和琼脂糖电泳法。光谱分析是通过吸收光谱及发射光谱的蓝移、红移来确定偶联是否成功。而琼脂糖电泳时由于偶联物大小与量子点大小不同而导至其电泳速度明显不同，通过对电泳条带分析，可以判定偶联是否成功  。

量子点的标记的优点

在免疫层析检测方面，量子点是一类新兴的荧光标记材料。在各种量子点中，CdTe量子点应用最为广泛。与传统的标记材料相比，量子点具有以下特性和优点：

（1）荧光强度高。量子点效率级数为0.5，稳定性好，抗光致漂白，ZnS包裹的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍、稳定性高100～200倍，且可以耐受多次激发。

（2）发光颜色多样。不同粒径大小的量子点发射光的颜色不同，也可以通过改变纳米晶的组成来达到调色功能（如：CdS发射蓝光，InP发射红光）。

（3）适应于空间及光谱的多重传输。

（4）量子点的冷光寿命一般在30～100ns。这个时间比背景荧光及大部分样本基质的拉曼散射光要长很多，因此可以减弱甚至消除背景荧光的影响。

（5）量子点波谱范围宽。量子点有较宽的吸收光谱，吸收光谱刚好延伸到紫外区域。量子点的发射光波长基本上独立于激发光波长。因此，单一波长激发光、一个波段的光谱或整个激发光源均可激发量子点，使其在整个可见光区域产生一个波谱比较窄的荧光。

在对量子点标记物的测定过程中，检测端使用光谱滤波法，对于利用量子点标记来实现空间多元测定分析方法而言，相当于增加了一个额外的空间维度。例如，当我们用含有不同激发光谱和发射光谱的标记物标记一种抗体来测定在同一层析膜上不同俘获带的不同分析物时，如果没有滤光片，则在每个俘获带每一种抗体的非特异结合就是杂信号的主要来源，分析物及抗体量越多，杂信号就越大。如果应用滤光片，在每个俘获带上，杂信号则只会来源于我们检测的一个标记抗体的非特异性结合。因此，通过滤光片，可以显著地改善信噪比，也可以有效地分析大量的分析物 。

量子点标记的不足

量子点标记能诱导氧自由基的产生，因此对生物活性物质具有一定毒性，不过这些毒性可以通过偶联到蛋白质分子上或者是覆盖一层低毒物质来降低。量子点和某些蛋白质结合后可能导至量子点的荧光减弱或淬灭，如铜/锌-超氧化物歧化酶对CdSe量子点的荧光有明显的淬灭作用。如果量子点标记用于试纸的制备，其使用过程中需要紫外光源用于色泽变化的观察，与肉眼观察即可判断检测结果的其他类型试纸相比，操作程序稍显复杂 。