临床化学的干扰实验-CLSI EP07-A3介绍

一、临床化学干扰的关注

1976年美国的Dr Young，将全世界发表的文章中，涉及影响检测结果的所有内容汇集一起，汇编成一本AACC的副刊，名字就称为临床化学检测结果干扰。当时，这本书引起了全世界的强烈关注。以后，开始出现了今天CLSI的EP07的标准文件。同时AACC不断将增加的内容加入该书中。到21世纪，将书分为几本书：分析前变异的影响、药物对临床实验室检测的影响、和疾病对临床实验室检测的影响。

CLSI（美国临床和实验室标准研究院）发布的EP07文件为“临床化学的干扰试验”。最早发布于1986年，为该文件的proposal版，2002年经修改后批准为EP07-A的正式文本。以后在2005年再次修改发布为EP07-A2版本；到2016年再经修改发布为EP07-A3版本。在该版本发布时，原先在EP07-A2文件中的附录，这是为了方便读者在开展干扰试验时需要的有关干扰信息，现在被重新形成EP35文件，另行发布。

二、EP07文件简介

SI EP7-A文件的目的是使临床实验室对检测系统或方法评估干扰特性方式一致。EP7-A叙述了厂商过筛可能的干扰物、确认干扰作用、和肯定病人样品中的干扰等的方法。文件也叙述了临床实验室为了确认干扰结果、和研究因为未预期干扰物使结果离散的方法。提供了详细的示例。

1、文件前言：临床检验具有显著误差。现有的统计质量控制只能监视检测的不精密度，和参考方法或参考品的比较了解不准确度，但是实验室不能方便地检测干扰物引起的误差。不断改进方法特异性是一个质量目标。本文件让实验室以医学需要来评估干扰物。为了使评估方案完整，并和评价技术协调，实验室和厂商需要理解一些概念，进行必要的选择，需要实验室和厂商的合作，他们都有实现改善病人结果的共同目标。为此，应共同证实某干扰的作用、确定它的原因、并设计改进方法等。注意：本文件注重分析过程的干扰。不是因药物和它的代谢物引起的生理作用。

2、文件目的：支持厂商和实验室方法的开发人员，在确定检测系统或检测方法对干扰物敏感时，以科学的确认实验设计、规定实验的各相应“干扰物”和浓度、明确数据分析和解释的方法，这样，可以评价出可能的干扰，并得到有意义的干扰结果给用户。实验室在研究因干扰造成结果误差时，进行系统的研究，明确数据收集和分析要求，鼓励实验室用户和厂商间的紧密合作，才能证实、揭示、最终消除新的干扰物。

3、文件范围：

1）分析方法

任何分析方法，定量或定性的，都会受干扰。本文件适用各种方法和分析仪。当然，针对不同评价方法的特点应有所修改。

2）标本类型

血清、血浆、全血、脑脊液、尿液、和其他体液都可以用本导则作评价。

3）干扰物来源

干扰物来自内源性和外源性：

• 在病理条件下如：糖尿病，多发性骨髓瘤，胆汁阻塞性肝炎等产生的代谢物。

• 在患者治疗中引入的化合物，如：药物，非肠道（注射）引入的营养物，血浆扩充剂，抗凝剂等。

• 病人摄入的物质，如：酒精，毒品，营养补充物，各种食物和饮料等。

• 在标本准备时外加的物质，如：抗凝剂，防腐剂，稳定剂等。

• 在标本处理时引入的污染物，如：护肤霜、手套上的粉末、血清分离剂、标本收集管的塞子等。

• 标本本身的基质效应，如：其化学和物理性质和理想的新鲜标本的差异。

4、概念和干扰的原理

1）干扰对不准确度的影响

形成不准确度（总分析误差）主要有3个因素：不精密度、和方法有关的偏移、和样品有关的偏移。对检测系统或检测方法的评价一般仅估计了前2个。和样品有关的偏移（即干扰）常被认为是个别特殊样品的问题，而不认为是方法的计量确认特性。从方法评价的做法上，干扰引起的系统偏移，具有系统和随机误差二者，这两种误差统计上都是不准确度（总分析误差）的组分。

对指定的病人群体，在标本中干扰物的平均浓度造成系统偏移，平时包括在方法偏移的估计中。对于各个标本对平均偏移的离散分布，在和较好的方法作比较时，表现为总的随机误差。对某些方法，随机干扰作用超出了作为随机误差主要来源的不精密度。

对个别病人，干扰物造成的偏移，依赖于病人标本中干扰物的浓度。偏移随干扰物浓度因清除或代谢程度而异。当病人状况变化时，偏移结果的变化也许会对病人状况产生错误的判断。

2）和临床的关系

检验医学必须把干扰和临床应用与观点相结合。由临床确定是否应将分析结果的影响看作干扰。必须明确地确定检测的分析物形式和它的浓度。很奇怪的是，一些分析方法的结果反映了真实分析物浓度，却没有临床意义。例如，火焰光度法和间接离子选择性电极法能准确检测血浆中的钠浓度，和脂肪浓度无关。但是，如果脂肪浓度很高，这些方法对电解质平衡的病人报告假性低血钠。而直接离子法在这种情况下能正确地报告正常钠，因为该方法报告的是血浆中水组分的钠活度，这正是体内调整的。但是，长期以来，临床观点一直是以火焰法为准，所以对样品中总钠的估计是过分了。由此，在解释干扰实验结果前，很重要的是首先确定临床关心的表达方式。

3）分析前的影响

在分析前，分析物或它的浓度出现了变化，称为“分析前影响”。这些“干扰”了实验结果的临床应用，但是，它们不是分析干扰。除非有特定规定，否则分析方法应在分析时检测分析时样品中所有的分析物，不论它原先有多少。

常见的分析前影响有：

• 体内药物的（生理）作用，如：药物作用使循环激素浓度的变化；

• 分析物因水解、氧化等的化学变化；

• 分析物的物理变化，如酶的失活；

• 标本的蒸发或稀释；

• 被外加分析物的污染（如静脉注射内的盐，血液标本长期不分离造成葡萄糖的损失，溶血使红细胞减少）。

4）相对干扰

相对于控制品或基础混合血清检测的分析物结果，干扰是计算出来的。有时候，控制品或混合血清中含有一定量的内在干扰物，即：获得混合血清的病人群体各干扰物的平均浓度。常见的是胆红素、血红蛋白、蛋白、和脂肪。有些方法补偿或纠正了干扰物的平均浓度，所以对病人群体的干扰作用已经降至很小。典型的方法包括标本的预处理、空白纠正、使用以血清为基础的校准品、和计算纠正。但是当干扰物浓度大于或小于病人标本的平均浓度时，会出现误差。

例如，某药物检测受蛋白影响，约每10.0g/L蛋白的偏移为0.05mmol/L。由于血清标本中的平均蛋白浓度为70.0g/L，相对于无蛋白混合液的偏移为0.35mmol/L。如果某方法已经纠正了平均偏移，则各个标本的蛋白浓度相对于平均蛋白浓度70.0g/L偏离每10.0g/L，使药物结果±0.05mmol/L。蛋白浓度为75.0g/L的标本具有的偏移仅为＋0.025mmol/L，不是0.40mmol/L。除非标本蛋白浓度正好为70.0g/L，每个病人的药物结果将依据实际蛋白浓度，都有少量的正或负偏移。

5）干扰的机制

干扰物对分析过程影响的方式有：

• 化学作用。干扰物和试剂竞争或抑制指示反应，干扰了结果。也可以因为络合或沉淀改变了分析物形式，产生干扰。

• 物理作用。可能干扰物具有和分析物相似的性质，如能产生荧光、颜色、光散射、洗脱的位置、或电的响应等被检出和检测出来。

• 基质效应。干扰物可能改变标本基质的物理性质，如粘度、表面张力、浊度或离子强度等，使检测的分析物浓度发生明显的变化。

• 酶的抑制。干扰物能通过抑制金属激活剂、和催化点的结合、或氧化必须的巯氢基等改变酶（分析物或试剂）活力。干扰物也能竞争酶反应中底物，形成干扰。例如，腺苷激酶会竞争和肌酸激酶（CK）反应的腺二磷（ADP），因此在某些CK测定方法中产生假阳性。

• 非特异性。干扰物会和分析物以同样方式参与反应。虽然不同干扰物的非特异性有差异，但是它们在检验中的实际作用是一样的。如：在碱性苦味酸的肌酐方法中酮酸的干扰；在一些重氮胆红素方法中受吲哚硫酸盐的干扰等。

• 交叉反应。在免疫化学方法中，干扰物的结构相似于抗原，也能和抗体“交叉反应”。这是一种非特异性。例如：在茶碱测定时咖啡因的干扰。交叉反应的程度是对免疫化学方法特异性的度量，但它不是对干扰敏感性的有用估计。

• 水取代作用。非水物质（蛋白、脂肪）占据了血浆中水的体积，影响了活度的检测。在要求报告血浆水中分析物浓度时，这些作用就不认为是干扰（有关水取代作用，我将另写微信介绍）。

5、干扰试验的判断限

在进行评估实验前，应该事先决定实验偏移多大时在临床上有意义，以此决定干扰影响的可接受限值。评估者必须确定检验结果用于临床时，干扰对分析影响的大小，在确定可接受规格时，要区分临床意义和统计意义。二者均重要。

1）临床可接受的限值

由干扰引起的允许误差的大小取决于检验结果的临床应用。一些项目的准确度要求（总允许误差）已经有了建议，可参见文献。有些项目的准确度限值可用以下的方法确定。可以将准确度（允许误差）分解为偏移、不精密度、和干扰因素，从中建立允许的干扰限值。在总允许误差中，除了方法偏移和不精密度，以及分析物的生物变异外，余下的为干扰部分（视作各个变量）。

（1）从生理变异考虑的限值

依据分析物的生理变异确定准确度要求的做法。原则上，认为相对于分析物在个体或群体中固有的变异（取决于检验项目的临床应用）可以消除的分析变异量为误差限值。这个方法对生理上可控制的分析物（项目）是合适的。

（2）从临床经验考虑的限值

常以临床专家的协调意见来确定准确度的要求。依据他们的经验协调，影响临床做出诊断或治疗的决定的误差限值为判断限。再由相关学科的临床专家共同确定准确度和干扰限值。

（3）从分析变异考虑的限值

从检测方法长期的总不精密度也可以得到干扰的限值。如果干扰作用相对于分析变异很小，如小于一个标准差；则由可能干扰物引起的误差增量不会影响临床的决定，该物质也不认为是一个干扰物。这个方法的缺点是许多现代检测系统具有很好的精密度，则干扰的限值比医学的必要性更重要。

2）统计意义（显著性）和作用

在确定某物质是否为干扰物前，评估者必须确认结果在统计上是有意义的。要求作适当的重复，这样可以有充分的把握来检出临床上有意义的干扰，也可以有足够的可信水平肯定不存在临床上重要的偏移。见以后依据检出可能性和可信限确定样本的大小。本导则适用的统计方法称为“假设检验”。评估者事先决定病人结果中多大的偏移在临床上是显著的。这个允许偏移量被认为是干扰限值。检验的无效假设认为没有干扰（即：偏移不超过这个限值），另一种假设认为有干扰（即：偏移超过了限值）。

3）实验的分析物浓度

应该在分析物的两个医学决定水平处进行初步的干扰评估。如果费用或其他问题限制初步实验只能作一个浓度时，这样有可能遗漏了其他浓度处临床上有意义的干扰。文件（目前被列为EP35）附录A列出了许多常见项目推荐的实验浓度。选用了公布的临界或决定值。有些项目因没有协同意见，则实验浓度是人为指定的。绝大多数项目是按照临床应用，选择参考范围的上限或下限、以及病理浓度。

4）实验的干扰物浓度

要确定某物质是否在“最差”的条件下引起干扰，实验室应该对病人标本中预期具有最高干扰物浓度进行干扰过筛实验。本文件有助于选择相应的实验浓度。不同的机理会产生阳性或阴性的干扰作用（如血红蛋白既具有过氧化氢酶的活力，又在可见光范围内有强烈的光吸收），对每个物质在两个不同浓度实验，可以避免实验浓度处对抗作用抵消的可能性。可以同时在多个分析物和干扰物浓度下实验。

（1）药物和代谢物

血清、血浆和全血的标本，至少在接受药物治疗剂量（急性峰浓度）下3倍于报告的最高浓度下、或在已知的最高预期浓度下做实验。若不知道预期的血液浓度，可以假定药物剂量被分布在5升体积，进行3倍于这个浓度的实验。参见附录A-Ⅱ中常用药物推荐的实验浓度表。作尿液检验时，确定在24 小时排泄的最大量，至少3倍于该量进行实验（每升尿液的量）。若不知道尿液的排泄量，至少进行3倍于每升尿液最大治疗剂量的实验。

（2）内源性物质

同样，预先估计在病人群体中具有的最高浓度，在此浓度下实验。见EP35推荐的一些常见的内源性组分实验浓度。

（3）抗凝剂和防腐剂

对于血清、血浆和全血，进行5倍推荐的添加剂浓度的实验，并应注意添加后立即实验。对于尿液，进行5倍于24小时尿液内每升含有的防腐剂量的实验。

5）干扰过筛实验

应在正式开始干扰试验前，进行过筛实验很有必要。如果加入物具有临床显著意义，考虑为干扰物；应继续实验确定干扰物浓度和干扰程度的关系。目前尚无实用的干扰评价实验方案能确认所有干扰物。一些干扰物（如药物的代谢物）在过筛中无法证实；而又会将一些物质误认为干扰物（如物质的形式不代表天然形式）。但是干扰过筛提供了标准化评估，补充了真实病人标本的研究。

注意干扰试验的两个局限性：

（1）加到混合血清中的化合物性质可能和体内循环的物质有差异。

（2）在检测的干扰物和分析物浓度时会抵消不同的干扰作用。因此，经常要观察几个胆红素浓度下血红蛋白具有的干扰作用。

因此，将真正的病人标本的资料和“配制”标本资料结合起来有助于确定真实性。