肿瘤基因检测丨有一种活检，叫液体活检；有一种标本，叫胸水上清！

2017年10月的第18届世界肺癌大会（WCLC）上，复旦大学附属中山医院呼吸科暨上海市呼吸病研究所胡洁教授团队的童琳博士就报告了胸水上清的研究，证实胸水上清ctDNA具有更高的肿瘤特有突变检出率和敏感性。凭借这项研究摘要，她获得了2017 WCLC的Travel Award（旅行奖）。³

▲ 2017年WCLC，胡洁教授团队的童琳博士所作报告

时隔近两年，2019年7月28日，该项研究结果正式发表于《Theranostics》杂志（IF=8.063），通过比较分析胸水上清、细胞沉渣、组织切片及外周血4种样本的基因图谱，进而证实了胸水上清标本进行基因检测的有效性和准确性，并进一步证实胸水上清标本在临床应用可能性。⁴

▲ 2019年《Theranostics》发表胡洁教授团队研究结果

▲ 胸水上清研究方案路径及临床指导意义

63例转移性肺癌患者，根据有无匹配肿瘤样本分为两个队列，队列1有匹配组织样本（n=30），队列2无匹配组织样本（n=33）。同时采集每位患者的胸水和血浆样本。分别对胸水上清和细胞沉渣进行DNA提取，分别简称为胸水上清细胞游离DNA（PE-cfDNA）和细胞沉渣DNA（sDNA）。所有样本都使用了南京世和基因 416基因 NGS大panel 进行测序。

▲ 63例患者登记和样本收集的研究设计

血浆ctDNA检测：EDTA抗凝管采集 8~10ml外周血，2h内采用两步离心法分离出血浆和血细胞，血浆做ctDNA检测，血细胞（白细胞）做对照检测；

肿瘤组织检测：FFPET 样本由病理学家测定每个样本的肿瘤细胞含量，然后进行组织的基因检测；

胸水样本检测：采集3~6ml胸水样本，用2500g离心15min，将上清液与漂浮细胞分离，上清液抽提PE-cfDNA，细胞沉渣（需要细胞涂片在400X倍镜下评估肿瘤细胞含量）抽提sDNA；

文库制备：KAPA Hyper Prep Kit；

测序方法：Illumina HiSeq 4000平台，2×150bp 双端测序；

检测灵敏度：肿瘤组织和细胞沉渣 0.5%，血液和胸水上清 0.1%，准确判断至少需要存在三条独立的reads（GATK）。

① 胸水上清中ctDNA（PE-cfDNA）含量远高于胸水沉渣细胞DNA（sDNA）和血浆ctDNA。提示PE-cfDNA具有更高的突变检出率及更高的突变检出丰度：胸水上清（98.4%）>胸水细胞（90.5%）>外周血（87%），避免血检造成的假阴性。

② 在匹配肿瘤组织的队列1中，PE-cfDNA的肿瘤突变负荷（TMB）与肿瘤组织相似（中位TMB 6.4 vs 5.6)，但明显高于胸水细胞沉渣 sDNA（中位TMB 3.3）和血浆cfDNA（中位TMB 3.4）。

▲ 四种样本类型检测TMB的情况对比

③ 在组织检测的驱动突变中，93%（27/29）在PE-cfDNA中检测到，包括ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、NF1、PIK3CA 和 RET 的突变，而在血浆 cfDNA 中检出率仅有 62%。在整个队列中，PE-cfDNA对EGFR驱动突变的检出率最高：胸水上清（71%）>胸水细胞（68%）>外周血（59%），避免血检造成的假阴性。

④ 比较分析ARMS-PCR和NGS检测不同样本EGFR突变的情况。证明NGS的方法是可行的，且胸水上清样本检出率是最高的。

▲ A) ARMS和NGS检测不同样本EGFR突变；B) NGS总检出率。

⑤ 胸水上清可克服胸水细胞学阴性和血性胸水检测突变的困难。即使是细胞学阴性，胸水上清 PE-cfDNA 仍可能检出突变；即使是血性胸水含有有核细胞，导至肿瘤细胞被稀释而降低胸水细胞沉渣的突变检测敏感性，但胸水上清的检出率并不受影响。PE-cfDNA与 sDNA 在血性胸水和非血性胸水中的检测灵敏度分别为：72% vs 81%，34% vs 64%。

在这种情况下，我们可发现 PE-cfDNA 比 sDNA 表现出绝对优势，说明 PE-cfDNA 是肿瘤DNA的独立来源，受肿瘤细胞丰度影响较小。

▲ C) 胸腔积液肿瘤细胞（+）或肿瘤细胞（-）中PE-cfDNA和sDNA检测的灵敏度对比；D) 血性胸水和非血性胸水中PE-cfDNA和sDNA检测的灵敏度对比。

当肿瘤组织不可用时，PE-cfDNA比 sDNA 和 血浆cfDNA 更适合用于基因组分析，而且可能更精细，是一种很有前途的肿瘤组织替代物。

研究数据进一步证明，在细胞学阴性或血性胸水标本中，PE-cfDNA比 sDNA 和 血浆cfDNA 具有更高的突变检测灵敏度，是一种更可靠的基因检测标本来源。

2018年《中华检验医学杂志》发表的《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》，对胸水样本的采集及处理提出了应用的建议：临床医师可通过胸膜腔穿刺术，采集胸腔积液 20 ml 置于预添加 EDTA 抗凝剂的无菌容器中（采集量视具体情况而定），采集完毕应即刻送至检测实验室，常温保存。建议 2 h 内完成两步离心分离上清（同血浆分离步骤），分离后的上清可直接进行抽提或保存于 -80 ℃冰箱直至抽提。⁶ 

如果需要长途保存运输，亦可采用cfDNA管（比如Streck管）采集胸腔积液 8~10ml 两管（约20ml左右），颠倒混匀后，常温（6~37℃）保存运输。cfDNA管中的游离DNA保护液不仅可以防RBC溶血，防WBC基因组DNA污染，还可以抑制核酸酶降解游离DNA。（基因Talks建议，仅供参考）

参考资料：

1.Wan Jonathan C M,Massie Charles,Garcia-Corbacho Javier et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA.[J] .Nat. Rev. Cancer, 2017, 17: 223-238.

2.Abbosh Christopher,Birkbak Nicolai J,Wilson Gareth A et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.[J] .Nature, 2017, 545: 446-451.

3.Tong L, Ding N, Li J, et al. MA 20.13 etDNA: Tumor-Derived DNA from Pleural Effusion Supernatant as a Promising Source for NGS-Based Mutation Profiling in Lung Cancer[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2017, 12(11): S1891.

4.Tong L, Ding N, Tong X, Li J, Zhang Y, Wang X, Xu X, Ye M, Li C, Wu X, Bao H, Zhang X, Hong Q, Song Y, Shao YW, Bai C, Zhou J, Hu J. Tumor-derived DNA from pleural effusion supernatant as a promising alternative to tumor tissue in genomic profiling of advanced lung cancer. Theranostics 2019; 9(19):5532-5541.

5.Gandara David R,Paul Sarah M,Kowanetz Marcin et al. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab.[J] .Nat. Med., 2018, 24: 1441-1448.

6.《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》,中华检验医学杂志2018年10月第41卷第10期.