平行分析早期乳腺癌ctDNA vs 组织突变，探究ctDNA临床应用价值

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率位居女性恶性肿瘤的首位，严重危害妇女的身心健康，早期发现和干预可以显著降低乳腺癌的死亡率。

▲ 乳腺癌患者不同分期5年生存率

乳腺影像报告和数据系统（Breast Imaging Reporting And Data System，BI-RADS）分类标准可广泛预测乳腺肿瘤恶性的可能性，但是，其阳性预测值（PPV）可能会导至大量非乳腺癌个体的过度治疗（比如 BI-RADS四类 可疑恶性，恶性风险只在2%~95%）。

同时，对于正在接受治疗的乳腺癌患者，某些生物标志物如 CA153、CEA 和 影像学检查 由于敏感性和特异性较差，不能很好地监测治疗反应。

目前还没有一种用于早期乳腺癌诊断和监测的临床活检生物标志物。直到液体活检的出现，特别是循环肿瘤DNA（ctDNA），在早期乳腺癌的诊断（鉴别）、分子分型和治疗监测中，显示出巨大的临床应用价值和广阔的应用前景。

早期发现和干预可以显著降低乳腺癌的死亡率。循环肿瘤DNA（ctDNA）作为一种具有临床应用价值的生物标志物，在早期乳腺癌的诊疗中具有广阔的应用前景。

本研究，对102例需要化疗的 早期乳腺癌患者 和 50例 良性乳腺肿瘤患者（BI-RADS 4A及以上但病理诊断为良性肿瘤）的 861份 血浆和匹配的组织标本，采用 NGS大panel（文中大panel指68基因热点及136基因全外两个panel） 进行检测分析。

102例需要化疗的早期乳腺癌患者进行血浆和匹配组织检测，检测的方法有两种：多重PCR法68基因热点检测 及 探针杂交捕获法136基因全外检测。

▲ 102例早期乳腺癌患者样品采集和ctDNA分析流程

① 1-36名患者：

检测panel：panel V1（多重PCR方法），覆盖68个乳腺癌相关基因的341个突变热点；

检测平台：Ion Torrent PGM & Proton Systems （Thermo Fisher）；

② 37-102名患者（及50例良性乳腺肿瘤）：

检测panel：panel V2（探针杂交捕获方法），覆盖136个乳腺癌相关基因的全部编码区；

检测平台：Illumina Nextseq 500 system（Illumina）。

① 本研究患者肿瘤组织表现出明显的瘤内异基因性（intratumor heterogeneities，ITHGs），ctDNA检测可以很好地解决这一问题。

▲ ctDNA检测可以很好地解决肿瘤异质性问题：为了了解ITHGs的模式、范围和性质，采用树结构方法将体细胞突变放置在树的不同部位。通常认为，在肿瘤发生的起始和发展过程中，树干的突变比枝或叶的突变更早发生（根据突变的数量和频率）。当根据突变在进化树上的位置对其进行分组时，在组织和血浆中，树干突变约占突变总数的一半（49%），而枝和叶的突变仅占突变总数的16%和35%。

② ctDNA联合BI-RADS分类标准与单纯BI-RADS分类标准相比，可以更准确的诊断鉴别早期乳腺癌，是一个乳腺癌早诊的生物标志物。

将本队列中74.2%的ctDNA检出率（49/66）与BI-RADS分类的预测结果相结合，阳性预测值可提高到92%（49/53）且具有显著的潜在意义（AUC=0.821），并可能减少手术的过度治疗。

▲ ctDNA与BI-RADS联合可准确鉴别EBC

③ 术后ctDNA阳性患者淋巴结转移率较高，提示可能复发和远处转移（术后ctDNA阳性患者淋巴结转移率升高至60%，术后ctDNA阴性患者淋巴结转移率降低至30%）。基底样和HER2+肿瘤亚型化疗后ctDNA阳性率明显降低，而管腔型肿瘤亚型化疗后ctDNA阳性率下降不明显。

▲ ctDNA阴/阳性与患者临床特征的关系

基于ctDNA检测评估的血液肿瘤突变负荷（bTMB）与肿瘤组织肿瘤突变负荷（tTMB）呈正相关，为肿瘤精准免疫治疗提供了一个潜在的候选生物标志物。

▲ bTMB与tTMB 皮尔森相关系数为 0.565

④ 本研究中，当ctDNA的阳性阈值达到 0.05% 时，panel V1 的ctDNA检出率达到 53%（19/36），panel V2 的ctDNA检出率达到 74%（49/66），而以往文献报道的早期乳腺癌ctDNA检出率较低（33~56%）。这说明ctDNA检测时，基因panel越大，覆盖的区域越广，对癌症的早期诊断能力也就越强（检出率越高）。

如果，将 panel V2 的检测阳性阈值调整为 0.1%、0.5%和1%，则相应的检出率分别下降到 64%（42/66）、24%（16/66）、18%（12/66），这说明ctDNA的检测深度越深则ctDNA检出率越高。

▲ V2组（N=66）ctDNA阳性检出率情况

⑤ 通过比较肿瘤组织的突变模式及其临床特征，发现PIK3CA突变在管腔型肿瘤（A型/B型）中比在基底样肿瘤（三阴性）中更为常见。

管腔型肿瘤的平均tTMB逐渐升高，luminal A型（5.26），基底样型（5.99），luminal B Her2-型（6.66），luminal B Her2+型（6.74），HER2过表达型 （10.60），luminal A型与HER2型差异具有统计学意义。

▲ 临床分子分型与平均tTMB的关系

这些数据表明 ctDNA评估是一种可行的、高灵敏度及特异性的生物标志物，可用于需要化疗的早期乳腺癌的诊断和鉴别诊断等。

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