病原体在生活中无处不在，对农业和人类健康影响深远，且病原体会对公共健康构成严重威胁，同时也是现代医学面临的重大挑战。广泛并且逐渐增多的耐药性，更是加剧了上述威胁。据世界卫生组织报道：“抗微生物药物耐药性(AMR) 是一种全球性的公共卫生危机，将会严重危害现代医学的发展”。因此，研究人员能够准确快速地进行病原体样本鉴定、深入了解耐药性的进化和传播、以及进一步了解潜在的治疗性干预策略至关重要。 纳米孔测序是一种更快速的抗微生物药物耐药性分析方法，在解决复杂的重复基因座结构方面具有显著优势，无需进行细胞培养，可直接对宏基因组样本进行抗微生物药物耐药性分析，生成更完整的抗微生物药物耐药性分析。纳米孔读长已作为一项独立工具或作为混合测序方法的一部分，成功应用于抗微生物药物耐药性分析，以帮助处理复杂的重复区域。在拼接含有不同耐药性基因组合的已知及新型细菌整合子区域方面，长读长极具价值 (图1)。
图1纳米孔测序解决了抗生素耐药性基因的基因学难题。在Helm等人的数据中，含有aadA和dfrA耐药性基因的纳米孔最长读长与肠道沙门氏菌整合子和大肠杆菌质粒pH1038-142之间的序列同源性为99％。纳米孔读长表明，attC区域 (已知在耐药基因盒的侧翼)位于aadA基因的侧翼，并且与ybeA基因相邻 (见于2类整合子)。图片由丹麦灵比市丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性中心的Sommer教授提供；选自《核酸研究》中的发表文章。 研究案例一：快速质粒测序和抗性基因检测 “使用纳米孔测序，可在6小时内交付完整的抗微生物基因检测。” 美国国立卫生研究院的研究人员应用纳米孔测序技术改进质粒组装，以进行快速的抗微生物药物耐药性鉴定。该小组首先使用一个连接测序建库试剂盒(Oxford Nanopore）对已经过充分表征的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯菌分离株的质粒DNA进行测序。长纳米孔读长的组装的一致性准确度达99％。通过对短读长技术获得的读长进行处理后，准确度可提高99.9％；然而，研究人员表示，对于潜在的未来临床应用，纳米孔测序具有更快速的周转时间。 研究人员还使用基于转座子的快速测序试剂盒(Oxford Nanopore）对来自另一个肺炎克雷伯菌分离株的质粒DNA进行了测序。研究人员报告称：‘使用质粒DNA可实现更低深度的测序，只需测序20分钟即可获得2000-5000个读长，并且组装足以对完整抗微生物耐药性基因进行注释’。
图 2利用不同的菌株，在三次测序运行中测定获得5000个纳米孔读长所需的时间量。使用基于转座酶的快速测序试剂盒（用于测序KPESBL-1肺炎克雷伯菌)，相比使用连接测序试剂盒（用于测序ECESBL-1大肠杆菌和KPNIH11肺炎克雷伯菌分离株)，能更快的产生数据。图片来自Lemon等人。 中国深圳研究院的研究人员也证明了对质粒DNA进行纳米孔测序可用于抗微生物药物耐药性分析，研究人员利用条码标签对12种多重耐药(MDR）细菌菌株进行了经济有效的混样文库测序。他们在单次8小时的测序运行中产生20个完整质粒（和1个接近完整的质粒)。值得注意的是，其中一个单个读长完全代表了一个> 90 kb的质粒，因此无需组装。研究人员还指出，在开始第一次运行的48小时内，可在单个纳米孔测序芯片上进行多次测序，显著降低了生成完整质粒序列的成本。 案例研究二：抗微生物药物耐药性-使用纳米孔数据探索肠道耐药基因组 “测序6-48小时后，鉴定出26个抗微生物药物耐药性相关基因，平均序列同源性为97.3％。” 肠道微生物组是一个富含抗微生物药物耐药性基因的环境，对抗生素治疗反应呈显著影响。可成为病原体获取靶向抗微生物药物耐药性基因的丰富来源。此外，肠道耐药性基因组在确定抗生素治疗对共生菌影响方面具有重要作用。目前，尚缺乏快速肠道耐药基因组图谱分析的有效方案。Helm等人旨在借助纳米孔测序技术解决这一问题。
案例研究三：细菌病原体鉴定 “通过联合针对16SrDNA扩增子的转座子制库和Centrifuge分析的方法，可在2小时内成功鉴定出菌属级别的细菌。” Mitsuhashi等人通过从20种细菌中汇集等摩尔比值的16S rDNA，制备了细菌模拟群落。纳米孔测序能鉴定出所有20种细菌，在菌种和菌属水平上鉴定精度分别为91％和97％ (图3)，该概念验证研究证明纳米孔技术可快速、精确地解析宏基因组样品的细菌组成。此后，Mitsuhashi等人继续检查了脓胸患者的胸腔积液样本，源自纳米孔数据的病原体鉴定结果与通过微生物学检查获得的数据相匹配。
图 3 1D纳米孔测序过程中，5分钟内实现了细菌模拟群落菌种和菌属级别分类，精度达90％以上(BLASTN)。图片由日本神奈川县东海大学医学院Imanishi教授提供。 |
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