哮喘是一个严重的全球性健康问题。这一疾病近10年的患病率、致残率、相关疾病的死亡率逐渐上升，至2016年全球受这一疾病影响的人群已达到3亿[1]。哮喘被认为是多种遗传因素与环境因素相互作用而引起的一种复杂的疾病。已积累的大量证据表明，儿童早期的呼吸道病毒感染是哮喘急性发作的主要环境危险因素，某些病毒感染引起的喘息发作是随后哮喘性疾病的独立危险因素[2]。2017版的《全球哮喘管理及预防策略》中指出哮喘的形成及其急性发作往往与上呼吸道的病毒感染有关(尤其是人鼻病毒)。人鼻病毒(humanrhinovirus，HRV)约占病毒引起的哮喘急性发作的65%，其次是呼吸道合胞病毒(RSV)，其他还有人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、冠状病毒、腺病毒等[3]。近年的一项大规模的出生队列研究表明，在生命的第一年里，至少在高危人群中，HRV感染对哮喘形成是一个比RSV感染更强的危险因素[4]。目前为止，HRV感染与哮喘之间的联系机制仍未明确。本研究对HRV感染与儿童哮喘形成与哮喘急性发作相关的临床和实验数据以及已提出的潜在机制进行了综述。对于HRV感染与哮喘之间关系的进一步了解将有助于儿童哮喘新防治策略的形成。
1 HRV概述 HRV是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus genus)的单股正链RNA病毒，病毒颗粒为直径27～30nm的20面立体对称结构。HRV基因组全长约7200bp，基因组结构包括5′端非编码区(5′untranslated region，UTR)、一个长的开放阅读框(ORFs)和3′端非编码区(3′untranslatedregion，UTR)。ORFs(长约6 500 bp)转录后的产物被HRV驱动蛋白酶剪切成11个蛋白，其中4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，构成壳粒，形成壳体包裹RNA。壳粒由12个五聚体构成，VP1、VP2和VP3的部分序列展示在壳粒表面，而VP4不暴露在壳粒表面[5]。 2 HRV分组 自1956年分离培养出第1株HRV以来，至今已发现160多种血清型，是感染人类的病毒中血清型最多的一类病毒。早期根据基因序列分析将HRV分为两组：HRV-A、HRV-B。典型的HRV-A及HRV-B分离株属于小RNA病毒科肠道病毒属内的不同分支，同一分支内多聚蛋白的非结构蛋白区P1、2C、3CD有超过70%的氨基酸同源性(近2150个氨基酸)。进一步根据主要衣壳蛋白VP1或VP4/VP2编码区的核苷酸同源性(>85%核苷酸同源)细分成基因型(与血清型相匹配)，目前HRV-A有78个基因型，HRV-B有30个基因型[6]。 自2006年以来，新1组HRV，HRV-C，逐渐被人们所认识，分子溯源表明HRV-C流传至少已有250年，目前已有60多个基因型被发现[7]。HRV-C与HRV-A、HRV-B具有相似的核酸碱基构成比例。HRV-C组内氨基酸同源性达68%～95%，与HRV-A同源性达64%～99%，与HRV-B型同源性达75%～97%[6]。HRV-C的物理结构预测结果表明其病毒颗粒表面至少有超过1/3的衣壳结构，这一特点与HRV-A、HRV-B明显不同[8]。 Huang等[9]发现，在对HRV 5′UTR进行分析时发现，部分HRV-C 5′UTR含有长度不一的属于HRV-A的5′UTR的基因片段，将其命名为HRV Cc亚组，以区别于之前的HRV C (HRV-Ca)，这说明HRV-C与HRV-A在5′UTR(非编码区)存在明确重组。Palmenberg等提出HRV-A可能发生种内重组，产生了1个新的HRV进化支：HRV-D。系统发生学证据和测序分析都表明，HRV-D很可能是新的1组HRV[8]。 3 HRV感染与哮喘的关系 目前已证实HRV感染不仅能够引起上呼吸道感染，与慢性肺炎的加重、哮喘的急性发作、婴幼儿和儿童严重的毛细支气管炎以及免疫功能缺陷的成人和老年人患致死性肺炎都有密切的关系[10]。 HRV，尤其是HRV-C感染，在儿童急性喘息性疾病及哮喘发作中发挥重要作用。COAST(theChildhood Origin of Asthma)的1项队列研究数据表明，婴儿期出现的至少1次的HRV感染相关的喘息性疾病是3岁时的持续性喘息最重要的危险因素。此外，对于6岁发生的哮喘而言，3岁前发生的HRV感染相关的喘息性疾病是比RSV感染相关的喘息性疾病或过敏原致敏都要强的危险因素[11]。另一项来自澳大利亚的高危出生队列研究报告了类似的结果：出生后第1年的HRV感染相关的喘息性疾病与5岁时增加的患哮喘的风险存在相关性[12]。Bizzintino等[13]研究发现，HRV-C感染是造成哮喘急性发作的主要HRV，与HRV-A、HRV-B感染相比较，其引起哮喘急性发作的程度更为严重。已有证据表明，早年患有HRV-C相关性气喘疾病将2到3倍增加因呼吸道疾病原因而住院的风险，3岁之前因感染HRV-C种病毒而引起喘息性疾病是导至6岁儿童患有哮喘的高危因素。患有HRV的儿童发生哮喘的可能性是普通儿童的4倍[14]。本研究室以无哮喘的儿童为对照人群，同时对诊断为急性呼吸道感染以及诊断为哮喘的儿童进行HRV检测及分型，研究发现HRV-A、HRV-C在哮喘患儿中的阳性检出率较HRV-B更高，而HRV-C是HRV与哮喘相关的决定性因素[15]。
HRV-C与HRV-A、HRV-B不同的是，它不能在传统的细胞培养系统中进行分离，其在呼吸道中增长更快，也对外界有更大的耐受性，但是还没有哪一项技术能够生产足够的病毒供大规模的生物研究。因此，HRV-C的信息主要来源于对有限的临床标本进行大规模的基因测序分析[8]。与HRV-B相比，HRV-A和HRV-C似乎是引起儿童下呼吸道疾病、喘息发作和急性哮喘的更常见的HRV。HRV-A/B在每个月份均有检出，但各季节阳性检出率比较均无统计学意义。HRV-C在每个月份中也均有检出，其中秋季阳性检出率显著高于春、夏、冬3季(P<0.05)，且HRV-C比HRV-A/B所致疾病更严重。HRV-C季节分布与HRV-A/B不同，提示HRV-C可能与其他HRV致病机制不同[16]。 4 HRV感染致哮喘的可能机制 HRV进入人体后，首先与呼吸道上皮细胞的特异性受体结合。呼吸道上皮细胞是HRV感染的靶细胞。研究表明，相对于流感病毒和其他呼吸道病毒，HRV感染的呼吸道上皮细胞数量相对较少，导至的细胞毒性也很低。此外，病毒脱落的数量和上皮损伤的程度与症状的严重程度无关。综合考虑，这些研究表明，HRV引起症状是通过特定的病毒致细胞病变效应，而不是通过直接的细胞毒性作用[17]，或者说HRV感染后的临床症状更可能是由于宿主的免疫反应所致[18]。 目前为止已发现3类HRV受体，其中少数HRV(theminor group)，包括12个HRV-A血清型，以低密度脂蛋白(LDL)受体家族为受体；多数HRV(the major group)，包括了其他的HRV-A及所有的HRV-B，共90余种HRV血清型，与细胞间黏附因子(ICAM-1)结合[4]；最近有研究报道，HRV-C可能是以钙粘素相关家族成员3(cadherin-related family member 3, CDHR3)为受体[19]。CDHR3有两个等位基因，在单核苷酸多态性(SNP)位点RS6967330的编码基因为TGT和TAT，其中G-编码的Cys529为天然的高丰度存在(69%)，但无临床相关性；而极少的A-编码的Tyr529(3%)被标记为"高效的"基因组，是儿童哮喘严重程度加重的易感基因位点"[20]。 不同组的HRV通过各自的受体所介导的内吞作用进入宿主细胞，但这一入胞过程是网格蛋白依赖的还是网格蛋白非依赖的取决于受体类型。一旦HRV进入宿主细胞，气道中的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)，包括Toll样受体(Toll-likereceptors, TLRs)、维甲酸诱导蛋白I(retinoic acid inducibleprotein I, RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiationassociated gene 5, MDA5)等识别HRV，引发促炎症及抗病毒反应[17]。 HRV感染后，首先在其感染与复制的初始部位气道上皮细胞内诱发促炎症反应。利用培养的人气道上皮细胞发现HRV感染可诱导多种细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-11)、生长因子(G-CSF、GM-CSF)、趋化因子(CXCL8、CXCL5、CXCL10、RANTES)的表达，这些因子有助于炎症细胞的活化并在气道聚集[21]。体内实验中HRV感染后这些细胞因子在气道分泌物中也增加[22]。预期上述各种因子可同时增强气道炎症及原有的过敏性炎症。在促炎性细胞因子作用下，HRV可诱导中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞等炎症细胞在呼吸道黏膜及黏膜下层积聚，使呼吸道上皮细胞屏障功能障碍，并激活呼吸道上皮细胞和其他细胞在肺部产生炎性介质，引起呼吸道症状[23]。 除促炎性细胞因子外，HRV感染还可触发气道上皮细胞释放Th2促分化因子，如IL-25、IL-33以及胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)，这些因子被认为是2型T细胞分化的关键因素。体内及体外研究均表明HRV感染的哮喘患儿支气管上皮细胞(Bronchial epithelialcells, BECs)中有很高的IL-25内在表达能力，且在HRV感染的过敏性哮喘患儿鼻液中IL-25水平升高；在HRV诱导的哮喘恶化的小鼠模型中也观察到了类似的结果。此外，阻断IL-25受体后2型细胞因子的表达、黏膜分泌物及炎性细胞募集均降低[24]。另外的人感染HRV模型研究发现在哮喘患者支气管黏膜分泌物中IL-33与2型细胞因子水平升高，而这些细胞因子的水平与哮喘急性发作的严重程度密切相关。同1个体外周血T细胞与2型先天淋巴样细胞产生的细胞因子是HRV感染BEC时诱导产生，而这种诱导作用是完全依赖于IL-33的[25]。TSLP也被认为是HRV感染与哮喘发作中特征性的Th2反应之间的一个潜在的分子链接。哮喘BEC体外模型研究显示dsRNA或病毒感染的替代物刺激下可诱导产生大量的TSLP，伴随IFN-β的降低[26]。此外，在过敏性哮喘的小鼠模型肺组织中的TSLP表达是HRV感染或暴露dsRNA所诱导的[27]。这些研究均提示上皮细胞分泌的介质在HRV诱导的哮喘急性发作中有潜在作用。 在抗病毒免疫应答中，干扰素属于针对病毒感染的非特异性防御机制，并且在其中起重要作用。实验和临床数据表明因HRV感染导至上皮细胞产生干扰素减少[28]。但有研究提示哮喘患者受损的上皮细胞产生的IFNβ和IFN-λ可能有助于病毒性哮喘发作。体外实验中IFN-λ和IFN-β的诱导与症状严重程度、支气管肺泡灌洗中的病毒载量及气道炎症呈负相关，而体内HRV感染实验中与肺功能降低呈正相关。在一项对学龄期哮喘儿童的前瞻性研究中HRV感染喘息儿童与HRV感染无喘息儿童相比IFN-γ1明显升高，提示IFN反应失调，而非简单的IFN产物缺乏介导了HRV诱导哮喘发作[29]。 HRV感染也可能通过增加呼吸道粘液分泌导至哮喘发作。体外研究显示HRV感染后人呼吸道上皮细胞黏膜蛋白-2(Muc2)、Muc3、Muc5亚型A和C(MUC5AC)、Muc5亚型B(MUC5B)、MUC6 mRNA表达增加，在表面细胞的裂解液及上清中黏蛋白MUC5AC及黏膜蛋白总浓度也增加[30]。 已证明HRV是气道重塑过程的主要调节剂，不仅涉及气道上皮而且涉及气道黏膜的其他组分。它们能够延迟支气管上皮细胞中的伤口愈合，还可通过诱导TGF-β、MMP-9和MMP-10的产生导至上皮下纤维化，使细胞外基质的降解和异常修复的增强。HRV感染还可影响气道平滑肌细胞的收缩能力，可能有助于哮喘发作。有限的体外实验和动物研究显示，HRV与气道平滑肌细胞表面的受体ICAM-1结合后，病毒无复制，也无细胞病变，但可增加气道平滑肌细胞的收缩，损害β-肾上腺素能受体激动剂的反应。另外的一些体外研究表明HRV可以感染多种其他类型细胞，包括成纤维细胞、单核细胞和巨噬细胞。这些细胞类型对哮喘急性发作的作用尚不清楚，需要进一步研究来确定[31]。 5 HRV感染致哮喘的宿主因素 虽然几乎所有的儿童(>90%)在婴儿期都感染了HRV，但形成持续性喘息或哮喘的比率远低于HRV感染率，因此，宿主因素，如遗传因素和过敏体质等，有可能与HRV感染后易于形成哮喘有关。 全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)一直以来都将哮喘易感性位点17q21与非过敏性儿童哮喘发病的相联系[32]。儿童哮喘的2项出生队列研究COAST、哥本哈根(Copenhagen)数据表明17q21变异体与生命早期的HRV喘息性疾病相关，但与RSV喘息性疾病无关；具有高风险基因变异体的儿童只要患上HRV感染性喘息后就会形成哮喘[4]。虽然已明确这一疾病有关的变异体可影响2个17q21基因GSDMB、ORMDL3的表达水平，但这些基因表达产物在哮喘发病机制中的作用还未完全明确。有研究揭示了ORMDL3基因在哮喘发病中的可能作用，这些作用包括未折叠蛋白反应失调、通过肌浆网/内质网Ca2＋ ATP酶引起气道炎症和重塑、鞘脂合成负调控导至气道高反应性等[33]。但一项体外研究得出了与出生队列研究相反的结果。该研究认为ORMDL3基因可能有抗病毒的作用，而非增加HRV感染的易感性。人呼吸道上皮细胞中ORMDL3基因的过表达使2’-5′寡聚腺苷酸合成酶的表达增加，而2’-5′寡聚腺苷酸合成酶可以通过RNase L活化降解病毒RNA进而抑制病毒复制[34]。因此HRV感染中ORMDL3的确切作用还需要更多的流行病学及实验性研究。GWAS近期的一项研究结果发现CDHR3(encoding cadherin-related family member 3，编码钙粘蛋白相关家庭成员3)是儿童早期哮喘的一个新的易感位点，可在呼吸道上皮细胞中大量表达。体外研究表明，该易感位点的基因突变可介导HRV-C进入宿主细胞，成为HRV喘息性疾病的高危因素。 HRV-C已在近期研究中被确定为主要的一类HRV，主要通过加重哮喘气道的炎症反应，破坏细胞免疫应答，促进血管生成和气道重塑、诱导杯状细胞化生和黏蛋白基因表达而致病。CDHR3相关研究结果表明HRV感染与有哮喘遗传因素的儿童哮喘易感性有关[25]。另外有不少研究提出过敏体质的致敏可能增加HRV引起喘息的风险。Th2型细胞因子，如白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13，在HRV感染本身增加ICAM-1的表达的基础上，可在呼吸道上皮细胞表面进一步上调90%血清型HRV受体ICAM-1的表达，这种反应可使上皮细胞更易受到HRV感染[24]。 总之，由于分子诊断技术发展，使HRV-C被发现，人们对HRV在儿童哮喘的发生及哮喘发作中的作用有了新的认识。目前的研究倾向于支持哮喘形成的"二次打击"学说，即宿主的遗传易感性加上HRV感染促使儿童哮喘发生。但需要更多的研究明确宿主的易感因素范畴及HRV感染引起哮喘的详细机制。 选自中华实验和临床病毒学杂志, 2018,32(3) |
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