外泌体正式进入临床检验，路还有多远？

一管血检测癌症，是全球医学界共同的梦想。液体活检作为传统活检的替代技术，通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是精准医疗代表性的诊断技术。液体活检的主要检测物包括血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和外泌体(exosomes)。作为液体活检领域的"三驾马车"之一，外泌体是细胞间信号转导的重要载体，具有丰富的可检测靶标(蛋白、DNA、RNA、脂质等)。虽然有大量的证据表明外泌体及其内容物具有成为新型诊断标志物的潜能，但其进入临床仍面临很多障碍。

1986年，Johnstone等^[1]在体外培养的绵羊红细胞培养液上清中发现外泌体，1996年Raposo等^[2]发现B淋巴细胞分泌的外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和黏附因子。2007年Lotvall和Valadi^[3]发现，细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。

2013年诺贝尔生理或医学奖授予从事细胞内囊泡(外泌体)运输调控机制研究的3位科学家，James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof，由此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮^[4]。2015年6月24日美国德克萨斯大学安德森癌症中心研究团队通过大量胰腺癌患者血清标本分析发现，早期胰腺癌患者血清中GPC1(glypican-1)阳性的外泌体丰度显著高于正常人群及慢性胰腺炎患者，可以作为一种非侵入性诊断和筛查处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌的标志物^[5]。

2016年1月，Exosome Diagnostics公司推出世界首款癌症外泌体诊断产品ExoDxLung(ALK)，实时检测非小细胞肺癌患者EML4-ALK突变，公司官方公布的检测诊断敏感度为88%，特异度为100%。此后该公司相继推出肺癌外泌体检测产品ExoDx LungT(790M)、ExoDx Lung(EGFR)，前列腺癌的尿液外泌体活检产品ExoDx®Prostate。癌症诊断领域之外，越来越多的公司参与到了研发基于外泌体为基础的诊断产品研发中，以Exosome Science公司为代表，陆续发布外泌体生物标志物诊断、监测阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病和其他神经系统疾病的研究数据^[6,7,8]。

外泌体在短短30多年的研究历程中，从基础研究走到了临床应用，成为液体"火"检三大标杆之一，与此同时外泌体也成为了资本市场追逐的焦点。Codiak BioSciences公司自2015年成立以来，募集总额达1.685亿美元。韩国外泌体干细胞治疗公司ExoCoBio，成立后4个月内A轮融资1 100万美元，成为韩国规模最大、投资最快的投资项目。国外已有多家公司推出外泌体分离试剂盒，国内也有多家从事外泌体检测服务的企业，分散分布于以液体活检公司为基本框架奠定的市场产业链中，包括：研究上游外泌体的提取、鉴定，试剂仪器供应市场；中游外泌体核酸扩增、蛋白质谱检测服务市场；下游数据分析市场。

虽然作为新型液体活检标志物，"新宠"外泌体被炒得火热，但仍需理性期待这一技术的应用。至少目前为止，几乎所有外泌体诊断产品都处于实验室开发的测试阶段，鲜有走出科研进入临床应用的。

(一)外泌体分离鉴定

建立快速、低成本、高纯度的外泌体捕获、鉴定、定量方法体系是外泌体进入临床检验的前提。目前最常用的外泌体分离富集方法为超高速离心法、聚合沉淀法、免疫亲和法、超滤法和凝胶排阻层析法^[9]。

目前有多种商品化外泌体分离试剂盒，包括基于聚合沉淀法的ExoQuick™(美国System Biosciences公司)、Total Exosome Isolation Reagent (美国Invitrogen公司)；基于免疫磁珠亲和法的Exosome-HumanCD9/CD81/CD63/CD81/EpCAM(美国Invitrogen公司)、Isolation Reagent Mag Capture™ ExosomeIsolation Kit PS(日本Wako公司)；基于超滤法exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (德国QIAGEN公司)等。

商品化试剂盒多采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)为多聚物的沉淀法、超滤法和免疫学方法分离外泌体。沉淀法以SBI公司生产的ExoQuick™(美国System Biosciences公司)试剂盒为代表，操作简便，不需要额外的设备。然而PEG沉淀会夹杂分离大量杂质(蛋白、脂类等)，此外，存在于分离物中的聚合物也可能会干扰下游分析^[9]。免疫法利用包被单克隆抗体的磁珠结合外泌体，可保证外泌体形态的完整，特异性高。使用抗肿瘤相关的HER2和EpCAM抗体可以分离出肿瘤特异性外泌体^[10,11]。然而，免疫沉淀需要特异性抗体，检测成本高，且仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，漏检率高。离心法是科研提取外泌体最常用的方法，但所需样本量大、耗时、回收率低(5%～25%)；凝胶排阻层析可以分开杂质获得高纯度外泌体，但受处理样本体积限制。微流控芯片集外泌体分离与检测为一体，但需要填充管道，损失外泌体检测体积^[9]。目前各类外泌体分离方法仅用于科学研究，远不能达到临床检测要求。

分离后的外泌体可通过多种电子显微镜进行形态学检测，如扫描电镜、透射电镜、冷冻电镜及原子力显微镜，目前研究文献中使用最多的为透射电镜；采用免疫印迹、流式细胞术等技术鉴定特异性表面蛋白标志物。外泌体是由细胞内多囊泡体与细胞脂膜融合后向细胞外分泌的囊泡，因此存在脂质双分子层结构，包括跨膜蛋白、细胞内源性蛋白、膜表面蛋白等(图1)。不同细胞来源外泌体蛋白成分存在差异。国际细胞外囊泡学会发布"证明样品中存在外泌体的最低实验要求"指导性文件中提出，采用蛋白标志物鉴定外泌体时，应同时检测到所分离样品中至少存在1个跨膜蛋白(如四次跨膜蛋白CD9、CD63，黏附分子等)、1个细胞内源性蛋白，如肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSGl01)、膜联蛋白A(annexin A，ANXA)、Rab家族蛋白(Ras-related protein Rab，Rab)，而不存在内质网来源蛋白，如钙联接蛋白(calnexin, CANX)、高尔基体基质蛋白(Golgi matrixprotein，GM130) 或核蛋白^[12]。

图1外泌体结构示意图

当下外泌体研究中最棘手的问题之一是如何准确测量评估外泌体纯度。满足检测需求的外泌体纯度，是后续内容物检测的前提。目前有两种从不同维度衡量外泌体浓度的指标：(1)外泌体蛋白浓度；(2)外泌体颗粒数。外泌体蛋白浓度通常使用二喹啉甲酸微量蛋白浓度试剂盒测定，外泌体颗粒数测量方法包括光学方法如纳米颗粒跟踪分析，动态光散射和流式细胞术^[13]，以及非光学方法，如电阻式脉冲传感，透射电子显微镜和拉曼光谱^[14]。目前尚不能通过单一方法准确定量外泌体纯度和浓度，未来的检测趋势是计算囊泡比率浓度(即"蛋白质与颗粒"比率)^[13]。

(二)外泌体成分检测

外泌体中含有多种核酸以及蛋白类等物质，可从不同角度监测肿瘤的进展与转归预后等的关系^[14,15]。每毫升血液中仅有1～10个CTC，而每毫升血液含有1×109个外泌体，含量极高。外泌体的脂膜结构对所包含的核酸分子起到良好的保护作用，具有更高的稳定性^[16]。外泌体的粒径较小，通透性强，容易到达各种体液中，是液体活检的前提条件；此外所有细胞都能分泌外泌体，包括肿瘤细胞及相关的免疫细胞，故能反映肿瘤微环境等多种信息。外泌体分离鉴定后，根据检测需求选取不同下游技术检测外泌体表面标记物或内容物，包括流式细胞术、质谱或二代测序等。那么何种成分检测最有可能在临床检验开展？

外泌体胞浆来源的属性决定其DNA含量很少，缺乏DNA检测信息。检测技术层面来说，蛋白不能扩增，很多重要的低丰度蛋白无法通过现有检测手段检出，蛋白检测需要寄希望于高敏感检测方法研发。外泌体内RNA可以进行扩增，目前外泌体RNA研究主要有两个方向，一种是利用测序技术直接获取RNA序列信息，另一种则是利用RNA扩增技术检测包含特定序列RNA浓度^[17]。前一种需要将特定序列捕获，分离纯化再进行测序，高通量测序技术可发现新的突变，但费用较高且检测时间略长；扩增子测序则使用特定的引物对样品进行多级PCR后纯化获得特定序列进行测序，临床应用简便易行，可动态监测突变位点，但需要提前了解肿瘤基因的突变信息。受益于测序技术的发展，RNA可能是有望最早成熟的外泌体成分检测技术。

然而，不管是外泌体核酸检测还是蛋白检测，最终都需要对数据进行深度分析处理以及解读。现阶段国内生物信息挖掘平台和人才，大多储备于商业性的基因组学服务企业。从短期来看外泌体测序检测只能服务于少部分经济条件允许的患者，而作为临床常规检测项目开展需要多学科的协同发展。

(三)检测质控标准

将外泌体研究成果转化为临床应用面临的关键障碍是缺乏标准化的技术规范，包括检测前(标本选择问题)，检测中(检测方法及鉴定统一标准问题，不同的内容物分析，不同检测手段)及检测后的每一个环节。

分析前质量控制，虽然处在检测标本进入实验室之前的环节，但却恰恰是最重要的环节。有明确证据表明血浆是外泌体分析最佳血液标本类型，样本收集应使用细胞稳定管或EDTA抗凝血管^[18]。但其他可能影响外泌体检测的分析前多种变量，如样本收集、样本处理、储存条件和时间以及与患者有关的生物因素等，仍不明确，需要进一步研究。

任何临床检测需要以检测方法的有效性为前提，尤其要注意接近检测下限的结果。较为理想的情况是能够有标准化的样品作为比较，然而目前外泌体标准品领域几乎为空白，几乎所有外泌体诊断研究均采用自建检测方法、自建检测区间。

高灵敏度和高特异性的检测一直是临床检验所期待的。外泌体因其独特的形成机制，丰富稳定的内容物，被誉为目前最理想的液体活检分析材料。然而高灵敏度的检测需要严格控制才能避免假阳性。由于缺乏统一的检测方法和标准，目前已公布外泌体研究结果的有效性、可重复性以及结果的通用性依然存疑。现阶段不同研究实验室使用的方法各异，检测的具体细节不同，不同外泌体检测可能无法给出相同的结果，研究结果具有不可比性。除已获批准的检测外，大多数外泌体检测方法的临床有效性和实用性缺乏相应的证据，尚需进一步研究。目前还没有确切的临床证据表明外泌体检测在临床试验之外能够用于肿瘤疗效监测、早期诊断或筛查。检测结果可比性、稳定性、有效性未明是外泌体检测进入常规临床的主要障碍。

外泌体检测是一项富有挑战性的新技术，在精准医学中扮演着越来越重要的角色。随着精准医疗纳入国家"十三五"规划，国家科技部决定在2030年前投入600亿用于发展精准医疗，国家卫生计生委也发布了一系列肿瘤诊断和高通量测序相关的文件和指南。外泌体相关研究定会乘着国家精准医疗战略的东风，实现长远发展。外泌体联合新一代测序技术、质谱分析技术将有望实现：疾病的早期筛查、实时监控、治疗反应监控、预后判断。此外，外泌体的诊断价值将更多展现在与CTC、ctDNA、传统肿瘤标志物的综合应用，充分结合ctDNA高灵敏度，CTC高特异性，实现疾病诊断全息化。未来，液态活检各种方式的联合使用将是大趋势。

目前外泌体检测还处在早期发展阶段，尚未开展多中心、大样本的基础以及临床研究，缺乏有价值的科研资料指导临床。外泌体检测真正进入临床，需要提高检测技术的灵敏度和特异性；实现血液采集系统和分析步骤等的标准化；通过多中心临床试验验证检测的临床效果。外泌体研究发展之路需要突破技术瓶颈、需要政策扶持，更需要符合伦理、合理引导、限定范围的有效监管。但随着广大科研工作人员的坚持不懈的探索和研究，新技术的出现和发展，分离检测流程的不断优化，外泌体必将会成为精准医疗疾病诊断领域的一块重要阵地。

选自中华检验医学杂志, 2018,41(7)