探针资本行业研究：单细胞测序行业研究（一）

随着询证医学的发展，人们对无论是诊断技术、对疾病本身的认知、以及疾病的治疗方法都发生着巨大的改变，同时，对诊断技术的需求也驱动着体外诊断在近20年迅速发展：从早期血球分析仪的出现、到生化检测仪的逐渐普及、再到化学发光仪的应用、最终到近五到十年间出现的基因检测，检测手段经历了从细胞形态学诊断、生化诊断、免疫诊断到分子诊断的发展过程。

分子诊断是应用分子生物学方法，通过检测受检个体或其 携带的病毒、病原体的遗传物 质的结构或含量的变化来为疾 病的预防、诊断、治疗提供信息和依据的技术。其检测对象主 要为核酸和蛋白质，以核酸分子诊断主。分子诊断主要包括原位杂交（in situ hybridization，ISH）、聚合酶链式反 应（polymerase chain reaction， PCR）、基因芯片和基因测序等，其发展大致经历了四个阶段。而基因测序近年在整个体外诊断市场中扮演着越来越重要的角色。

图1：分子诊断主要技术发展时间轴

（图片来源：分子诊断研发与市场发展概况，周琳颖，苏燕，许丽，徐萍）

基因（Gene）指一段携带遗传信息的DNA片段，是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因是控制生物性状的基本单位，通过指导蛋白质的合成来表达所携带的遗传信息，从而达到控制整个生物个体的总体性状表现。同一个生物体中的每个细胞都含有相同的基因，但并不是每个细胞都会对所携带的基因进行相同程度的表达，不同部位和不同功能的细胞所表达的基因的部分也不一样。人类大约有2~2.5 万个基因，已知的人类基因组的大小约30亿BP。

基因检测（Genetic Test）是指通过对DNA、RNA、蛋白质及代谢物质进行分析，来指导治疗方案的选择。通常，基因检测可以用于诊断、预测或预防遗传性疾病的发生，或预测、预防疾病的复发，也可以作为评估个人健康情况的依据。

基因检测的应用可分为临床相关基因检测与非临床应用基因检测，包括：

-单基因/染色体遗传疾病诊断与基因携带筛查，如目前已知的BRCA1和BRCA2的突变与乳腺癌患病几率的关系；

-多基因遗传疾病基因检测，如大多数癌症、阿尔兹海默症、2型糖尿病、青光眼、心脑血管疾病等；

-药物基因体学，研究基因如何影响个体对药物的反应；

-先天体质、特质、潜能分析，身份鉴别、亲子关系鉴定等。

基因检测的方法可分为：传统生物分子学技术，基因测序，及基因芯片。广义的基因检测主要包括三大类技术：标的物的提取及杂交、扩增和测序。

目前中国的基因检测公司主要提供疾病易感基因的检测服务，大都为多因素所致疾病，如肺结核、过敏性鼻炎、银屑病、乳腺癌、阿尔兹海默症等。就检测数量而言，如今DNA测序在临床中的“突破性”应用是产前诊断。产前诊断旨在识别染色体数量异常，例如唐氏综合征，且仅依赖于母体血液内少量的胎儿DNA，因此，产前诊断被誉为“医学史上发展最快的基因检测”。业内专家估计每年全世界约有400万到600万孕妇接受产前检查，而这个数字将在未来10年内超过1500万。产前诊断的特点也为DNA测序在初级护理中的应用提供了思路：无创、简单，对具体核苷酸序列准确性要求低（染色体计数无需考虑核苷酸序列的变异）。

在高收入国家，基因组测序已经常规性地应用于患有难以诊断的先天疾病的儿童的诊疗。对DNA序列进行分析能够找到其中约30%病人的致病突变。在一些病人中，通过基因测序得到的诊断能够显著提高医疗质量，缩短诊断时间，提供更清晰的临床信息。

过去40年里，DNA的测序方法在不断更新。20 世纪 70 年代 至今，基因测序技术经历了4 代的发展:第一代是英国生物化学家 Sanger 的脱氧链终止法( 1975 年，首次完整的基因组测序，是人类基因组计划得以开展的关键) ，第二代为基于焦磷酸的高通量测序法( 1996年，目前普遍应用的测序技术) ，第三代为单分子 DNA 测序法，第四代是纳米孔测序法 。

图2：基因测序技术发展历程

（图片来源：基因测序技术及其临床应用，中华临床实验室管理电子杂志2014 -11）

1. 单细胞测序简介

在过去的几十年里，研究人员对于来自许多物种的成千上万的基因组进行了测序。几乎在所有情况下，译解的DNA都是从数百万的细胞中提取出来并混合到一起。同一组织中的细胞往往被认为是具有相同状态的功能单位，传统的检测手段分析的是细胞群体的总体平均反应，是在样本中数量上占据优势的细胞的特征（如高异质性的实体瘤组织），因此，传统的测序方法无法解读生物的生长发育机制，也无法分析那些环境中数量极少的细胞（如产前诊断中的胎儿细胞）。

通过对单个细胞的 DNA 或 RNA 进行测序，表明组织系统层面的功能是由异质性细胞构成的。单细胞测序技术是能够在单个细胞的水平上，对基因组进行高通量测序分析的一项新技术。与传统高通量测序相比,单细胞测序不仅能够分析相同表型细胞的遗传异质性，还能获取难以培养微生物的遗传信息。

图3：单细胞测序技术发展历程

（图片来源：Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies）

注：(A) Timeline of SCS milestones.  (B) Histogram of the growing number of publications in SCS over the past 5 years.  (C) Prevalence of publications categorized by fields.

诚然，单细胞测序的发展并非是基因测序技术层面的革新，而是在测序技术的发展之上的测序思路的改变和创新。细胞在增殖、分化和代谢的过程中内因和外因 共同作用，造就了细胞之间的差异性。即使是同源的两个细胞，细胞内物质组成和含量也会有很大差异。传统的测序思路对群体细胞的分析只能给出一个稳态的平均结果，无法表征细胞间的差异性，于是单细胞测序技术应用而生。

2. 单细胞测序技术分析

单细胞测序以单个细胞为单位，通过全基因组或转录组扩增，进行高通量测序，能够揭示单个细胞 的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，单细胞测序技术的流程主要包括单细胞分离、细胞溶解与基因组DNA获取、全基因组扩增、测序与数据分析4个方面，本节以该技术流程为主线，解释了现有技术的内容及优缺点。

单细胞测序的步骤可分为：样本制备 - 即单细胞的分离与单细胞内遗传物质的获取，样本扩增 – 将单细胞内的所有遗传物质进行扩增，和测序与数据分析。目前，阻碍单细胞测序走进临床的主要原因为两点的技术基础未能达到要求。本节将详细分析各环节的技术发展情况。

2.1单细胞分离

单细胞识别和分离的技术需要满足一下几个要求：分离技术对细胞伤害小、分离时精确度和识别率高、操作易学、成本合理等。目前，可以用于分离单细胞的技术分为两类：

-非标记法：利用细胞的物理性质，如密度、体积、质量、电学性质、光散射性等，进行分离；

-标记法：在细胞上标记一些小分子，如荧光、磁珠等，再进行分离；

主要技术包括：

-梯度稀释法(Serial Dilution)

-显微操作技术(Micromanipulation)

-荧光激活细胞分选 (Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)

-微流控技术(Microfluidics)

-激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection, LCM)。

梯度稀释法是通过将细胞悬浊液进行一定程度的稀释后分离单个细胞的方法。这种方法主要依据统计学原理：当细胞悬浊液被高度稀释且单个分装的滴液足够小时（如10μL），每个滴液含有的细胞数量可以低于一个。实验证明，利用这种分离细胞的方式，每个每个液滴中含有各种细胞数目( 如 0、1、2、……个/滴) 的几率符合泊松分布( Poisson’s distribution) 规律。该方法已被长期用于不同组织的单克隆细胞培养及研究中。

图4：梯度稀释法流程图

（图片来源：Wikipedia）

利用稀释法获取单细胞的优点在于技术简单、成本低廉，但其缺点也非常明显：在分离过程中容易出现分离错误或者丢失细胞、实际的分离效率难以保证，且这种方法仅适用于样本可以培养的研究。

荧光激活细胞分选（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS）是一种借助流式细胞仪，根据细胞特异性分子标志或细胞光散射特征，分选单个或群组细胞技术。FACS是目前最常用单细胞分类技术，用激光束激发单行流动的与荧光素标记抗体相结合的细胞，根据激发的荧光信号对细胞进行分选。FACS的工作原理为: 细胞不同的理化或光学特性经激光照射所产生的光散射信号，通常能被荧光染料等人工合成物所增强。细胞样品经荧光染色后，受气压驱动进入鞘液（无荧光本底的平衡电解质溶液）流动室再由喷出，然后用超声振荡搅动液流使液流断裂成一连串最多含有一个细胞的均匀的小液滴；细胞经激光照射产生荧光和散射光信号后，由下游的光学系统收集、分析细胞特异性信号。如果样品细胞的 信号与目标细胞的特性相符，则在刚形成液滴时被 选择性地瞬间感应正电荷、负电荷或不带电荷，从 而在电磁场的作用下发生偏转并进入对应的收集管。

FACS法可以测量细胞的多个特征(比如大小, 粒度, 内外荧光等)， 且准确度、灵敏度和通量均处于较高的水平。虽然整体过程较为复杂，但FACS技术成熟，有统一的标准。但 FACS 需要大量的悬浮细胞作为原始材料，可能影响低丰度细胞亚群的产出；此外，仪器中快速流动的液流、及FACS过程中涉及细胞的消化及分选等因素，可能对细胞的活性及表面标记产生影响，从而影响实验结果的准确性。

图5：FACS法流程图

（图片来源：Sino biological）

显微操作技术是利用显微操作仪直接人工操作实现单个细胞的分离。显微操作仪通常由倒置显微镜和电动机械控制的微针构成 - 微针是一根具有吸头的毛细玻璃管。操作者在显微镜下寻找悬浮于液滴中的目标细胞样品，手工或通过显微操作仪将微针靠近并吸取目标细胞，然后转移至收集容器。

其优点是操作容易进行，通过直观、准确地分离单个细胞，并且设备、材料成本低但人工成本高，主要用于较小细胞群体中的目标细胞分离，高效地控制单个细胞的吸收和释放。但这种方法通量较低，分离过程中容易损伤细胞， 且细胞识别的过程中容易出错，未来或依赖于半自动化的细胞分离设备克服这些部分不足。

微流控技术是在微米级结构中操控微小液体的科学与技术，方肇伦院士在《微流控分析芯片的制作及应用》中将微流控技术定义为一种在微米级结构中操控纳升及皮升体积液体的技术。微流控芯片使得单细胞的培养、制备、反应、分离、检测等步骤集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。在微流控领域中很多根据细胞不同的物理性质通过外加的磁场、电场等来实现某类细胞的筛选、继而捕获单个细胞。近年文献中公布的单细胞分析的微流控装置方案能用于单细胞分离和操作的设备装置多基于以下三种原理: 油基液滴分离、气动微阀、流体动力学细胞陷阱技术。

图6：微流控技术流程图

（图片来源： Single cell sequencing: a distinct new field）

微流控技术的应用使得实验研究试剂用量减少，在反应效率得到提升的同时极大地抑制了污染的发生，还减少了操作误差，实现了更高的可靠性和更好的平行性。

激光捕获显微切割（LCM）是一种同通过冻切片从细胞群中分离出纯细胞群或单一细胞，并在显微镜下观察其特异性的方法。LCM需要先将样本放入冰冻切片机中处理，之后通过激光束使覆盖于组织切片上 的透明膜熔化，冷却后目的细胞被固定于黏附膜上，从而实现细胞分离。其中，冰冻切片的制作是 LCM 技术中关键的一步，其质量的好坏直接影响 LCM 对目标细胞的 捕获及后续试验结果的准确性。目前LCM大多用在与人类健康相关的单细胞基因组学研究中。

LCM基本不损伤组织结构和待测细胞周围组织的形态完整，可以把控待测样本的质量。但用这种技术来获取单细胞的花费高、许多时候切割不够精确，且UV对DNA/RNA可能造成一定程度的损伤甚至丢失细胞核遗传物质。

图7：LCM技术流程图

（图片来源： An optimized protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture micro dissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing）