有关食物过敏的实验诊断

本文作者：天津医科大学医学检验学院 李会强 教授

1.食物过敏相关知识

人体内有完善免疫系统，以应对病原微生物的入侵，维持人体的健康。然而，免疫系统有时出现错误免疫应答，给人体健康带来负面作用导至疾病发生，如食物过敏。食物过敏隶属变态反应性疾病，即已致敏的机体再次遇到相同抗原时引起病理性免疫应答，给机体造成生理功能紊乱或组织细胞的损伤。研究证实，食物过敏是由免疫球蛋白E（IgE）介导，肥大细胞和（或）嗜碱性粒细胞参与，过敏原交联致敏细胞表面IgE抗体引起生物活性介质释放，生物介质作用相应组织器官所致的生理功能紊乱，临床表现有皮肤症状、胃肠道症状、呼吸系统症状、严重引起休克[3]。针对不同过敏原的IgE抗体称为“过敏原特异性IgE抗体”即sIgE抗体（special IgE antibody，sIgE）。过敏原sIgE抗体的产生与B细胞分化为浆细胞时免疫球蛋白的类别转化密切相关，此过程受到白细胞介素4、5、13等细胞因子调控[1]。此外，在食物过敏反应过程中，同样会产生针对过敏原的免疫球蛋白G4（IgG4），即特异性IgG4（special IgG4 antibody，sIgG4）；过敏原sIgG4不能结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞，但具有中和过敏原、缓解临床症状的作用[4]。

人体内的抗体（IgG、IgM）通常以“游离”状态分布于体液（血液）中，但人体内IgE抗体的分布具有特殊性。由于IgE分子具有很强亲细胞性，而肥大细胞和嗜碱性粒细胞具有高亲和性IgE Fc 受体（FcεR），体内绝大部分IgE分子分布于上述两种细胞表面而呈现“结合”状态，且结合状态的IgE分子具备更长的半衰期[5]。基于上述分析，过敏原sIgE抗体检测同样包括两种情况：其一，血清中sIgE抗体检测，采用血清学方法，即采用已知抗原检测未知抗体模式；其二，细胞表面sIgE抗体检测，采用细胞学方法，即模拟体内细胞活化过程，用已知过敏原激发，观察活性介质释放，证实细胞表面sIgE抗体存在。

分子免疫学认为，任何B细胞克隆具有单一抗原识别受体（BCR），诱导特异性抗体产生的基本单位是抗原表位（Epitope），而不是完整蛋白分子，单一蛋白分子（抗原）往往具有众多抗原表位。针对食物过敏而言，患者体内sIgE抗体是非常复杂的，是一组针对不同过敏原（蛋白）的sIgE抗体的混合物，也是多组针对同一蛋白、但抗原表位不同的抗体分子的混合物[6]。同时，由于种族、饮食烹饪习惯、个体间免疫功能等存在差异，食物过敏原sIgE抗体具有复杂的个体间异质性，而此种异质性同样给sIgE抗体检测带来新的复杂性[7-8]。

2.血清学检测

如前文所述，血清学sIgE抗体检测是以“血清”作为样本，采集静脉血分离血清，sIgE为游离状态（Free），检测方法基于抗原-抗体结合的免疫化学原理，即已知抗原检测未知抗体的分析模式。目前，国内过敏原sIgE抗体主要采用两种方法，分别是膜条法和单管法。

膜条法基于斑点酶免疫分析（dot enzyme immnunoassay，dot-EIA）原理，采用硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜为固相载体，包被标准已知抗原（食物蛋白），或将已知抗原喷涂在NC膜表面（通常在不同物理位置，喷涂系列已知抗原）并封闭干燥备用，采用生物素标记的抗人-IgE抗体和亲和素标记的碱性磷酸酶（SA-AP）作为检测系统。膜条法可一次检测多种过敏原（sIgE），但过敏原种类相对固定不能随机组合。单管法基于荧光酶免疫分析（fluorescentenzyme immunoassay，FEIA）的原理。首先，此方法采用单管测定模式，以称为“CAP”的多孔、亲水性纤维为固相载体，具有足够吸附面积和较好吸附蛋白的性能，适合包被标准的已知抗原（食物蛋白）；其次，将包被有标准抗原的CAP置于反应杯内，患者血清待检sIgE抗体与CAP表面的标准抗原结合形成复合物；标记抗体（检测抗体）为β半乳糖苷酶标记的抗人IgE抗体；4-甲基伞形酮-β-半乳糖苷作为荧光底物。单管测定法具有较高分析灵敏度，可准确定量sIgE抗体水平，被视为过敏原sIgE抗体检测的金标准[9]。

无论采用何种标记免疫分析技术，单管检测还是膜条检测，血清学间接法测定sIgE抗体的核心问题是已知抗原的标准化和包被环节。首先，已知抗原标准化是结果准确性的物质基础，任何过敏原组分的缺失或不足，均可能导至错误结果的出现。天然抗原纯化是非常复杂的过程，处理方式不同会导至蛋白的降解或缺失[10]。重组抗原由于制备方法简单，容易标准化，近年来备受关注[8]。其次，如何将不同性质蛋白包被在有限面积的固相材料表面，如何避免不同蛋白与相应sIgE抗体结合时形成的空间位阻（steric hindrance），如何根据待检人群针对特定食物过敏原sIgE抗体谱的规律，调整不同标准抗原的相对比例等，同样是食物过敏原sIgE抗体检测过程中必须解决的重要问题。

近年来，随着食物过敏原研究不断深入、重组过敏原广泛使用，国外学者提出“单组分蛋白”检测sIgE抗体的分子诊断新理念[11]。分子诊断（molecular diagnostics）基于蛋白分子水平，不是以“食物种类”为单位，而是以“单一”抗原（蛋白）作为已知抗原，检测针对此种蛋白的sIgE抗体，故又称单一组分诊断（component-resolved diagnosis, CRD）。从检测方法角度，分子诊断会解决上文所提到的各种问题，提高过敏原sIgE抗体检测结果的准确性。同时，从临床应用价值角度，分子诊断可提供更为详细的过敏原sIgE种类（抗体谱）信息，做到精准检验并为精准脱敏治疗奠定基础。

3.细胞学检测

众所周知，皮肤点刺试验（skin prick testing，SPT）是确定食物过敏原的重要方法之一，但由于隶属体内试验具有一定风险性，且制备标准过敏原非常困难，临床应用受到限制。嗜碱性粒细胞激活试验（basophil activation test，BAT）于体外几乎完美模拟体内嗜碱性粒细胞的激活过程，具有与SPT近似的临床价值，不受药物治疗干扰，逐渐受到临床关注[12]。

细胞学检测以“嗜碱性粒细胞”作为观察对象，需采集抗凝血分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cel，PBMC），以分布于致敏细胞表面sIgE抗体（binding）为检测对象，采用已知过敏原（抗原）激活PBMC中的嗜碱性粒细胞，通过观察嗜碱性粒细胞的活化状态，证实细胞表面过敏原sIgE抗体的存在[13]。BAT隶属细胞生物学检测方法，采用新鲜全血标本（细胞悬液），可以反映加入的标准抗原与细胞表面sIgE抗体结合、形成“抗原桥”激活细胞的过程。因此，BAT反映过敏原sIgE抗体的生物学功能，只有亲合力强的sIgE抗体才具有较强的激活细胞脱颗粒的能力。换言之，BAT能测定过敏原sIgE抗体的致病活性，与人体内的真实情况比较接近[7]。

BAT采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）的方法，比经典的组胺释放试验（Histamine release tes）的更可靠、更简单。FCM通过荧光标记的特异性抗体来识别嗜碱性粒细胞表面的活化标志物，定量分析活化的嗜碱性粒细胞数量，可反映嗜碱性粒细胞的活化程度和功能状态。首先，采用抗-CD123单克隆抗体和抗HLA-DR单克隆抗体，并结合散射光信号对PBMC中的嗜碱性粒细胞进行“圈选”，嗜碱性粒细胞CD123+、HLA-DR-。其次，采用抗CD63抗体或CD203抗体作为嗜碱性粒细胞的活化标志物，活化细胞表现为CD63阳性，未活化细胞表现为CD63阴性。CD63，又称为溶酶体相关膜糖蛋白3（LAMP-3），可表达于多种细胞如单核细胞、血小板、嗜碱性粒细胞表面。CD203c，又称为Ⅱ型跨膜胞外酶E-NPP3，是一个细胞外的核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶，它仅表达在嗜碱粒细胞和肥大细胞及其前体细胞表面。当嗜碱性粒细胞处于静息状态时，嗜碱性粒细胞表面的CD63、CD203c处于较低水平，而在激活状态时，嗜碱性粒细胞脱颗粒，CD63 、CD203c大量、快速表达，成为活化的嗜碱性粒细胞的特异性标志物[12]。

BAT可用于过敏原包括食物过敏原的检测，显示出较高特异性和敏感性。BAT可评价食物过敏患者严重程度，弥补血清sIgE抗体定量检测不能反映体内活性的不足[14]。BAT可用于评估脱敏患者再次接触食物过敏原的风险程度[15]。

展望

综述所述，过敏原sIgE抗体作为食物过敏诊断、免疫治疗及风险评估的重要指标，血清学方法简单、快速，适合临床实验室使用，而细胞学检测方法能真实反映sIgE抗体的致病性，具有较好的诊断特异性和敏感性。但是，细胞学检测操作复杂、检测成本较高，不适合临床实验室使用。过敏原sIgE抗体与高亲和性抗原表位作为“抗原桥”形成、细胞活化的分子基础，基于抗原表位水平的过敏原sIgE抗体的检测方法能够反映抗体的致病活性，相应的适合临床实验室使用的血清学检测方法值得期待。

作者简介

李会强，1989年7月毕业于天津第二医学院医学检验专业（现天津医科大学），并于2007年7月获南开大学生命科学院微生物学专业硕士学位。现任职于天津医科大学医学检验学院临床免疫学检验教研室，教授职称，教研室主任，临床检验诊断学硕士研究生导师，主讲“临床免疫学及检验”和“标记免疫分析基础与临床”课程，已从事医学检验专业的教学和科研工作近30年，于2016年授予天津市教学名师。近十年来，主要从事“标记免疫分析方法学”和“食物过敏实验诊断”领域的科学研究工作。截止目前，申请人作为第一发明人获得国家技术发明专利授权9项，近5年以通讯作者发表学术论文50余篇（其中SCI收录2篇）。

参考文献

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