CMDE审评报告全文公开，新添1项创新产品

一、申请人名称

厦门艾德生物医药科技股份有限公司

二、申请人住所

厦门市海沧区鼎山路39号

三、生产地址

厦门市海沧区鼎山路39号

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

本试剂盒含有P-EGFR混合酶、P-EGFR阳性对照、P-EGFR 8联反应条和P-EGFR反应液，主要组成成分见表1。

表1  试剂盒主要组成成分

（二）产品预期用途

本试剂盒用于体外定性检测晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆DNA样本中人类EGFR突变基因。其中19外显子缺失、L858R突变用于盐酸埃克替尼片的伴随诊断检测，T790M突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测（具体可参照表2）。

血浆EGFR检测敏感度尚不能达到组织样本检测水平，因此推荐用于晚期NSCLC患者，且作为不易获取NSCLC组织样本时的补充手段。如可以获得病理组织时，建议优先考虑病理组织检测结果

表2  伴随诊断用途的突变基因类型及相应的靶向药物

注：甲磺酸奥希替尼片的功效尚未在EGFR T790M血浆样本检测结果阳性、同时肿瘤组织样本检测结果阴性或未知群体中确定。

下表3中为本试剂盒可以检出，但EGFR相关药物安全性和有效性尚未确定的EGFR突变基因类型。

表3  药物安全性和有效性尚未确定的EGFR突变基因类型

本试剂盒仅用于对NSCLC患者靶基因序列的检测，其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。

（三）产品包装规格

12测试/盒

（四）产品检验原理

本试剂盒基于扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）和荧光PCR技术实现血浆DNA样本中EGFR突变基因的检测。

本试剂盒针对EGFR突变基因位点设计特异的突变检测引物。PCR扩增时，由于该引物3'末端的碱基与突变型模板完全配对，引物延伸并扩增出突变模板；而与野生型模板由于不能完全配对，引物的延伸被阻断，野生型模板扩增被抑制，从而实现EGFR突变基因的检测。               

本试剂盒同时结合荧光PCR技术，通过FAM/ROX/CY5标记的荧光探针，实现EGFR突变基因的实时检测；另外,反应体系中还包含检测人类EGFR基因保守区域的引物和HEX标记的荧光探针，作为内控试剂用于结果判读及监控样本的质量。本试剂盒PCR扩增反应系统同时含有UNG酶，可以选择性断裂含有dU的PCR片段中的尿嘧啶糖苷键，有效降低因PCR产物污染产生的假阳性。

二、临床前研究摘要

（一）主要原材料

1.本产品的主要原材料包括：引物、探针、DNA聚合酶、UNG酶、dNTPs等，这些原材料均为外购方式获得。

引物、探针均为申请人自行设计后由专业的合成公司合成，并经HPLC纯化获得；DNA聚合酶和UNG酶均由原料提供商克隆表达纯化后获得；dNTPs由原料提供商直接化学合成获得。

2.申请人选择2家有资质的供应商，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商。制定了各主要原材料质量要求并经检验合格。

3.企业参考品设置情况：

申请人设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品。阴性参考品包括EGFR突变基因阴性血浆DNA、EGFR突变基因阴性且其它基因阳性(BRAF、HER2、KRAS突变基因阳性)的血浆DNA和非人类基因组样本DNA，阳性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品采用临床EGFR突变阳性血浆样本DNA、质粒DNA、EGFR突变阳性细胞系DNA与阴性血浆DNA混合，经数字PCR定量制备而成。

阳性参考品涵盖了每种突变类型，其中强阳性参考品30份、中阳性参考品30份、弱阳性参考品30份，共90份单突变阳性参考品（临床EGFR突变阳性血浆样本DNA、质粒DNA、EGFR突变阳性细胞系DNA与阴性血浆DNA混合），1例L858R/T790M双突变参考品（细胞系DNA），共91份。这91份参考品均用数字PCR定量突变比例。

阴性参考品包括8份EGFR突变阴性的血浆样本DNA、3份EGFR突变阴性而其它突变基因阳性的血浆样本DNA和1份非人类基因组样本DNA，共12份，经数字PCR和Sanger测序法验证均为EGFR突变基因阴性。

最低检测限参考品涵盖每种突变类型，由突变类型的质粒/细胞系DNA与健康人血浆样本混合制备，得到1ng/μL DNA浓度下0.2-0.8%突变比例的最低检测限参考品。

精密度参考品包括强阳性精密度参考品、弱阳性精密度参考品和阴性精密度参考品。强阳性精密度参考品涵盖了18种突变类型（临床EGFR突变阳性血浆样本DNA、质粒DNA与阴性血浆DNA混合），共18份；弱阳性精密度参考品涵盖了30种突变类型（临床EGFR突变阳性血浆样本DNA、质粒DNA与阴性血浆DNA混合），共30份；阴性精密度参考品3份（临床EGFR突变阴性血浆样本DNA）。其中，强阳性和弱阳性精密度参考品的突变比例分别为50%和1%，所有精密度参考品均经过数字PCR验证。

本试剂盒设置了阳性对照质控品，内含有突变质粒和野生型DNA，用于检测过程中试剂和仪器的质量控制；此外，每管反应体系还设置了内控（人类EGFR基因保守区域），用于检测结果的判读及监控样本的质量。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人通过使用初步确定的配方进行反应体系配制，以企业EGFR参考品/质控品，对反应体系中的突变引物浓度、突变探针浓度、内控引物/探针浓度、Taq DNA聚合酶、UNG酶浓度、Mg离子浓度、dNTPs浓度、PCR buffer用量、Blocker用量、PCR反应体积、PCR扩增循环数、退火温度、样本DNA用量、PCR适用机型（Stratagene Mx3000P™、ABI7500和宏石SLAN系统）、核酸提取试剂盒（QIAamp Circulating nucleic acid Kit和厦门艾德的核酸提取试剂）等进行筛选和优化，每种组分选择2-4个参数，通过功能性试验，最终确定了最佳的生产工艺和反应体系。

（三）分析性能评估

本产品分析性能包括最低检测限、精密度、阴/阳性参考品符合率、特异性（交叉反应、干扰试验）、核酸提取纯化性能等。

在最低检测限评估中，用3批成品试剂盒（P214072505Z、P214080103Z、P214080504Z），评估特定背景DNA浓度（3ng/反应、7.5ng/反应和15ng/反应），每种EGFR突变类型设置 3个突变比例、20次重复的检测；同时采用3批成品，评估了每种突变类型在特定突变比例下，3个背景DNA浓度、20次重复的检测情况，最终确定各突变位点不低于95%检出率的最低检测限为15ng/反应DNA浓度下0.2%-0.8%突变比例。   

在精密度研究中，申请人采用阴性精密度参考品、弱阳性精密度参考品（1%突变比例）和强阳性精密度参考品（50%突变比例）在3批成品试剂盒（P214072505Z、P214080103Z、P214080504Z）上分别评价了本产品的批内、批间及检测日内、日间和操作者间精密度，结果显示Ct值CV值均在5%以内，表明试剂盒的批内、批间及检测日内、日间和操作者间精密度均较好。

本试剂盒采用91份阳性参考品和12份阴性参考品在3批成品试剂盒（P214072505Z、P214080103Z、P214080504Z）上分别评价了试剂盒的特异性和准确度，阳性和阴性参考品的符合率均为100%。

交叉反应评价中，申请人针对EGFR基因具有同源性、可能引起交叉反应的其它突变基因类型、易引起交叉反应的野生型、与非人类基因及肺相关感染微生物等进行交叉反应评价。所用样本包括HER2基因质粒DNA（103拷贝/μL）、血浆样本DNA（1ng/μL）、细菌/酵母菌/结核分枝杆菌/肺炎链球菌DNA（1ng/μL），经验证，上述样本与本产品均不产生交叉反应。

干扰试验结果显示血浆样本中可能存在的内源性干扰物（血红蛋白、甘油三酯、铁蛋白等，浓度分别为2g/L、37mmol/L和200ng/mL），以及外源性干扰物（紫杉醇、卡铂、特罗凯、柠檬酸钠等，浓度分别为90μg/mL、90μg/mL、90μg/mL和0.645mol/L），均不干扰本试剂盒的检测结果。

针对核酸提取纯化步骤，申请人对比了Qiagen公司的QIAamp Circulating nucleic acid Kit和厦门艾德的核酸提取试剂对81份血浆样本的DNA提取效率，结果显示上述两种方法核酸提取效率相当，提取样本用于本试剂盒检测，性能可满足要求。通过以上评价，选择QIAamp Circulating nucleic acid Kit和厦门艾德的核酸提取试剂作为本产品核酸提取方法。

本次申报产品仅包括1种包装规格（12测试/盒），申请人提供了三批产品（P214072505Z、P214080103Z、P214080504Z）在所有适用机型上的性能评估资料。以上性能研究符合44号公告要求。

（四）阳性判断值研究

本产品用于阳性判定值研究的血浆样本来源于厦门艾德生物技术研究中心有限公司，该样本EGFR突变情况经数字PCR方法验证。

对于临床常见的19-del、L858R和T790M突变类型，申请人均采用了94例临床样本进行检测。使用3批成品试剂盒（P214072505Z、P214080103Z、P214080504Z）在Stratagene Mx3000P™、ABI7500和宏石SLAN系统三种机型上，对提取的DNA进行检测，通过SPSS软件对ROC曲线进行分析，根据Youden指数最大值确定其阳性判定值。

对于20-ins、S768I、G719X、L861Q稀有突变类型，申请人使用3批成品试剂盒（P214072505Z、P214080103Z、P214080504Z）在Stratagene Mx3000P™、ABI7500和宏石SLAN系统三种机型上进行检测，采用与数字PCR平行对比的方法进行阳性判定值的确定，其中用于20-ins分析的临床样本为45例，其它稀有突变样本各50例。

通过上述检测分析，最终确定本产品阳性判断值见表4。

表4  阳性判断值的确定

ΔCt值= Ct值FAM/ROX/CY5 —Ct值HEX/VIC。

（五）稳定性研究

申请人对本产品实时稳定性、热加速稳定性、冻融稳定性、开瓶稳定性进行研究，确定了在各种条件下本产品的有效保存时间。

实时稳定性研究：采用三批次试剂盒（批号：P214111401Z、P214112001Z、P214112602Z）储存于-20±5℃条件下，分别在0、2、4、6、7、8、9和10个月对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察，各项性能指标均符合要求，确定产品在-20±5℃条件下，可稳定保存8个月。

热加速稳定性研究：将三批次成品试剂盒（批号：P214111401Z、P214112001Z、P214112602Z）解冻后，放置于37℃保存，在第0、3、5、7天对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察，结果显示，产品在37℃条件下，可稳定保存7天，检测性能均满足要求。

冻融稳定性研究：将三批次成品试剂盒（批号：P214111401Z、P214112001Z、P214112602Z）按照规定条件于-20±5℃存储至完全结冰，再取出置于室温完全解冻，如此反复冻融数次，分别在反复冻融第0、2、4、6、8和10次后对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察，结果显示，产品反复冻融10次，性能均满足要求。

开瓶稳定性研究：将三批次成品试剂盒（批号：P214111401Z、P214112001Z、P214112602Z）解冻后，拆开包装，将P-EGFR 8联PCR反应条、P-EGFR反应液、P-EGFR混合酶、P-EGFR阳性对照开盖后再盖紧，分别置2～8℃和-20±5℃保存。2～8℃保存的试剂盒在第0、3、5和7天，-20±5℃保存的试剂盒在第0、4、6和8个月对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察。结果显示，开瓶后的试剂盒在2～8℃保存7天和-20±5℃保存8个月，各项性能指标均满足要求。

三、临床评价摘要

(一)一致性临床研究

申请人在复旦大学附属中山医院、云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院）、温州医科大学附属第一医院、上海市胸科医院、北京协和医院和首都医科大学附属北京胸科医院共6家机构完成了临床试验。采用考核试剂与已上市产品对临床样本进行比较研究试验的方法验证本产品的临床性能。入组样本为晚期（IIIB-IV期）肺腺癌和少量非肺腺癌、肺腺癌IA-IIIA期的血浆样本，共计1069例。对比试剂选择已上市同类产品人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）（注册证号：国械注准20143402001）。考核试剂与对比试剂检测结果不一致的样本或两种试剂检测均为阳性且不能具体分型的样本，采用高通量测序方法（NGS）进行序列测定。

本临床试验共检测出373例突变阳性样本，阳性率为34.89%，包括168例19del突变阳性、168例L858R突变阳性、69例T790M突变阳性、11例20-ins突变阳性、14例G719X突变阳性、13例S768I突变阳性、8例L861Q突变阳性。

与对比试剂的比较研究结果显示，二者阳性符合率为97.35%，阴性符合率为89.7%，总符合率为91.86%。采用kappa检验方法进行统计学分析，Kappa=0.81，显示二者具有较好的检测一致性。

在1069例样本中，两种试剂检测结果不一致或不完全一致的样本共122例，68例样本NGS方法的验证结果与考核试剂检测结果一致，42例样本NGS方法的验证结果与对比试剂检测结果一致，12例与两种方法检测结果均不一致。

申请人对1041例肺腺癌样本按照不同治疗疗程分为初治、复发、TKI耐药复发组，对各种突变的组间差异进行比较，19-del突变在酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药复发组检出率最高，与其他两组有显著差异；L858R突变在TKI耐药复发组检出率最高，其次是初治组，三组之间有显著性差异；T790M突变在TKI耐药复发组检出率显著高于其他组；其他突变在各组中的检出率无显著差异。

（二）组织与血液样本的配对研究

统计温州医科大学附属第一医院229例入组样本的组织EGFR检测结果，其中有203例组织与血浆样本为同一时期采集，采用考核试剂检测血浆样本，与同一受试者既往组织检测结果（人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）国械注准20143402001）进行对比，结果表明考核试剂血浆检测结果与组织样本检测结果阳性符合率65.55%，与已往文献所述的结果相符。

（三）EGFR-TKI药物疗效相关的临床研究

1.甲磺酸奥希替尼片（泰瑞沙）药效相关研究

AURA17研究是一项开放性、单臂药物临床研究，旨在评估甲磺酸奥希替尼片（泰瑞沙）在亚太地区确诊为局部晚期或转移性NSCLC（IIIB-IV期）、既往接受已批准EGFR-TKI药物治疗后出现疾病进展、EGFR T790M突变阳性患者的安全性和疗效。此临床研究中，合计306名（255例来自中国）初步符合入组条件的受试者参与筛选。其中277名受试者能提供足够的组织样本，且经中心实验室检测确认，其中183名受试者组织样本检测出EGFR T790M突变阳性。这183名受试者后续均接受甲磺酸奥希替尼片（泰瑞沙）治疗。在这183名受试者中，有168名受试者能提供同时期血浆样本，该产品在这168例血浆样本中共检测出82例T790M突变阳性。其中有77名受试者服用甲磺酸奥希替尼片（泰瑞沙）后可评价疗效，评价结果为49例病情得到缓解，客观反应率为63.6%（95% CI:52，74）。

同时，申请人进行了接受甲磺酸奥希替尼片（泰瑞沙）治疗的回顾性临床试验研究，此产品在首都医科大学附属北京胸科医院、温州医科大学附属第一医院、云南省肿瘤医院3家临床机构共检测出7名受试者血浆样本检测结果T790M突变阳性，受试者均为经已批准EGFR-TKI药物治疗后复发进展的晚期非小细胞肺癌患者。这7名受试者后续服用甲磺酸奥希替尼片（泰瑞沙）后，5例病情得到缓解，2例病情稳定，客观反应率为71.43%，疾病控制率为100%。

上述研究表明，此产品可以用于帮助NSCLC患者选择甲磺酸奥希替尼片（泰瑞沙）的肿瘤靶向治疗方式。

2.盐酸埃克替尼片（凯美纳）药效相关研究

申请人进行了接受盐酸埃克替尼片（凯美纳）治疗的回顾性临床试验研究，本产品在首都医科大学附属北京胸科医院、温州医科大学附属第一医院、云南省肿瘤医院3家临床机构共检测出48例晚期非小细胞肺癌受试者血浆样本EGFR敏感突变阳性。这48名受试者后续服用盐酸埃克替尼片（凯美纳）后，29例病情得到缓解，18例病情稳定，1例病情进展，客观反应率为60.42%，疾病控制率为97.92%。

这项研究表明，此产品可以用于帮助NSCLC患者选择盐酸埃克替尼片（凯美纳）的肿瘤靶向治疗方式。

3.其它EGFR-TKI药效相关研究

申请人进行了接受其它EGFR-TKI治疗的回顾性临床试验研究，该产品在首都医科大学附属北京胸科医院、温州医科大学附属第一医院、云南省肿瘤医院3家中心共检测出29例晚期非小细胞肺癌受试者血浆样本EGFR敏感突变阳性。其中27名受试者后续服用吉非替尼（易瑞沙），2名受试者后续服用盐酸厄洛替尼片（特罗凯）后，19例病情得到缓解，9例病情稳定，1例病情进展，客观反应率为65.52%，疾病控制率为96.55%。但因该部分其它EGFR-TKI有效样本量未达到预期统计学要求，未能进行具有统计学意义的临床研究，故本次临床研究中未明确其他EGFR-TKI与本产品伴随关系。

综上所述，该产品临床试验资料对产品的临床性能进行了全面研究，临床试验符合要求。

四、风险分析及说明书提示

参照“YY/T 0316-2016 医疗器械风险管理对医疗器械的应用”标准，对该产品进行风险分析。经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品上市带来的获益/受益大于风险。

尽管目前认为该产品的受益大于风险，但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的防控，已在产品说明书中提示以下信息：

1.适用范围：用于体外定性检测晚期NSCLC患者血浆DNA样本中人类EGFR突变基因。其中19外显子缺失、L858R突变用于盐酸埃克替尼片的伴随诊断检测，T790M突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测，其它稀有突变本产品检测试剂可以检出，但EGFR相关肿瘤药物安全性和有效性尚未确定。

2.警示及注意事项：产品说明书中介绍了该产品检验方法的局限性及使用中的注意事项。

本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册，属于创新审批项目（编号：201600177）。申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第680号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令2014年第5号）等相关医疗器械法规与配套规章，经系统评价后，建议准予注册。