液态活检到底准不准？| 正见

JAMA Oncology文章引爆液态活检的全球大讨论

撰文 | 贾士东博士

sjia@predicine.com

责编 | 戴佳凌 

Dai.Jialing@PharmaDJ.com

施樱子

Shi.Yingzi@PharmaDJ.com

液态活检是肿瘤组织活检的有效补充，在过去的几年里进展迅速。液态活检在2015年度被MIT Technology Review评为世界十大突破技术之一。

然而，今年年内的两篇文章在全球液态活检领域掀起了狂澜大波。研究发现，美国不同公司Guardant Health（GH）、Foundation Medicine（FMI）和Personal Genomics & Diagnostics（PGDx）的液态活检结果大不相同。

来自美国约翰霍普金斯大学医学院和华盛顿大学的学者们以GH为对照，分别用FMI和PGDx进行的肿瘤液态活检（ctDNA）对比。结果显示不同检测技术在相同基因突变的检测结果上存在明显差异，与产品宣称的高灵敏性、高特异性形成鲜明对比。这不由引起了行业从业人员、临床医生与社会大众对于ctDNA液体活检可靠性的担忧。

约翰霍普金斯大学的学者上周在世界知名临床期刊JAMA Oncology发表文章《Patient-Paired Sample Congruence Between 2 Commercial Liquid Biopsy Tests》，比较了同一患者同时抽取的血液样本送到GH和FMI两家公司进行液态活检的检测结果。分析显示，对应于相同的基因变异名单，GH和FMI两个检测平台在62.5％（25/40）的患者中检测到基因变异。其中3例（7.5％，3/40）患者的基因突变谱在GH和FMI检测中完全吻合，6例（15%，6/40）部分吻合，16例（40%，16/40）不吻合。

华盛顿大学今年7月在JAMA子刊JAMA Oncology发表文章《Comparison of 2 Commercially Available Next-Generation Sequencing Platforms in Oncology》， 研究显示同样选择了GH和FMI两家液体活检公司对9名患者的血液样本进行了检测。结果显示，一位患者在两家都没有检测到突变，剩下的8名患者中共检测到了45个突变，其中只有10个基因变异（22%，10/45）的结果在两个公司的检测报告中是吻合的。其中 2名患者检测到的基因突变谱在GH和FMI两家的检测报告中完全不同。

同一样本在三个国际公认的权威ctDNA公司检测结果不同。上述报道在全世界掀起了一场对液态活检准确性的讨论。

但如果把搜索的范围拓宽一些，最近发表的另外几项数据则提示了完全不一样的信息，这些研究数据表明，在晚期癌症患者中，肿瘤组织和血液中的肿瘤基因变异检出率高度吻合。

在2016年ASCO年会上，GH向全世界公布了其基于1.5万患者的液态活检结果。该研究检测了15191例病人的17628份血液标本和398位病人的组织标本。结果发现，在83%病人的血液中能够检测到ctDNA。其中有398位病人有对应的血液样本和肿瘤组织样本。针对这些患者，基因变异在血液样本和肿瘤组织中的总体吻合率可高达87% （336/386），若血液检查和组织活检相差六个月内，血检和组织活检中基因变异检测结果的吻合率可高达98% 。结果发现，肿瘤基因变异在血液中和肿瘤组织中的吻合率达到了87％。

上周，美国哈佛医学院麻省总医院（MGH）在著名癌症期刊Cancer Discovery上发表文章《Genomic landscape of cell-free DNA in patients with colorectal cancer》表明，应用GH技术发现肿瘤基因变异在血液和肿瘤组织中的吻合率达到了令人吃惊的95％。

FMI、PGDx和很多临床科研结果支持这一结论，应用同一个检测平台，在晚期癌症患者的血液中肿瘤基因变异检出率与肿瘤组织高度吻合。

那么为什么同一个肿瘤患者的样本在不同的公司检测出来的液态活检结果会不同？

目前市场上的主流液态活检都集中在ctDNA领域。全球的领军企业当属位于美国硅谷的GH，该公司开发了第一款基于ctDNA的液态活检产品。FMI和PGDx是美国ctDNA液态活检市场上的后起之秀。GH，FMI和PGDx都是经过世界最严格 CLIA和CAP资质通过的企业。在实验操作流程和数据结果解读方面严格遵循国际标准，流程结果应该无可挑剔。

说到这里，我们不得不对液态活检进行专业上的解析。与组织活检的基因检测比较，液态活检的难就难在巧妇难为无米之炊。肿瘤细胞基因变异片段的ctDNA会游离在血液中，而液态活检相当于事实上的大海捞针。

值得注意的是，上述两篇文章仅仅对于三类ctDNA基因检测平台的最终报告进行了分析，对于原始数据包括具体的测序深度、涵盖基因、差异的统计学显著性，未见详细数据。因此，很难对导至基因检测结果产生差异的具体原因作出准确分析。从现有的报道数据，我们可以做出一些合理的推测。

从约翰霍普金斯大学文章提供的信息，若干样品的所有不一致点突变都来自于某一个panel，可能是样品在运输和预处理的环节发生了ctDNA降解或gDNA污染。ATM, ALK, BRCA1这三个基因在PGDx检出率非常高，很可能起源于PGDx较强的白名单。

从技术流程角度， 三家公司都使用自主开发的实验技术，遵循世界最严格 CLIA和CAP标准的操作流程，采用自己的探针进行目标靶点捕捉、标记、扩增、富集和测序。不同公司测序产品对突变基因的侧重点不同，可能造成目标基因的最终收益数量存在差别。加之不同公司使用的二代测序平台不尽相同，不同检测平台 对于同一位点的覆盖度和效率可能存在差异，导至同一样本出现不同的检测结果。

从数据分析角度，测序深度与LOD（检测敏感度阈值）的差异也会导至差异。三家公司都开发出了独特的生物信息学数据解读流程和基因变异的阈值设定。公开材料显示，GH的阈值是可以低达0.25%，FMI的阈值是0.5%，PGDx的阈值是可以低达0.5%。华盛顿大学的文章显示了GH的液态活检技术对于等位基因变异频率（AF，allele frequency）较高的点突变检测准确率较高。检测结果的差异主要发生在AF接近LOD（检测敏感度阈值）附近，这取决于GH生物信息学分析中的阈值设定。同一样本同一基因变异位点在不同检测平台之间的不同阈值下会产生差异。加之在生物信息学层面，界定LOD算法各不相同，这些因素决定了不同检测技术平台对于同一个样品、同一个位点可能得出完全不同的结论。

当然，这两篇文献不足以充分证明ctDNA检测结果的特异性存在问题，上面的数据也揭示了ctDNA液态活检可能存在的假阴性和假阳性情况。

从上面的分析可以看到，液态活检是一个涵盖实验操作和数据分析的复杂过程。与上面提到业界顶尖企业相比，中国有超过200家的ctDNA液态活检公司，存在鱼龙混杂、技术水准和产品开发能力参差不齐的问题。

最近的ctDNA液态活检结果的差异也为中国的同行企业敲响了警钟。我们是否已经为ctDNA产品开发做好了充分的验证工作？是否应该把技术开发做的更加扎实、把基础研究做的更加扎实？相对于液态活检技术的新颖性，临床医生更关注的会是诊断的准确性，而精准诊断又是精准治疗的基础，诊断正确的重要性不言而喻。

新年里会有更多的液态活检数据，让我们拭目以待。