循环肿瘤DNA（ctDNA）：从科研逐渐走向临床

循环肿瘤DNA广泛存在于血液中，是肿瘤释放重要的基因水平标记物。相对于传统的肿瘤标记物，ctDNA具有半衰期短、假阳性率低的特点。ctDNA直接来自肿瘤原发灶或转移灶中癌细胞的脱落，这些DNA分子可以真实反映实体肿瘤细胞的遗传变异，更全面地反映肿瘤各个亚群的情况。

1948年，外周血循环DNA首次被发现；1977年，研究人员进一步发现肿瘤患者体内存在循环DNA；1994年，在肿瘤患者血液中检测到重要癌基因RAS变异，表明外周血中部分循环DNA来自于肿瘤。此后，如何利用这一标志物来改善现有的癌症诊断及监控效果一直是肿瘤领域的重要研究方向。

相比循环肿瘤细胞，ctDNA在血液中的含量更高，但是由于没有方法对这些特殊DNA进行分离富集，在很长时间内应用ctDNA直接进行肿瘤检测的技术都没有取得进展。直到最近十年，研究人员通过特殊PCR扩增方法实现了部分重要肿瘤的基因位点检测，才使得临床上应用ctDNA进行肿瘤的液体活检迈进一步。

美国约翰霍普金斯大学科学家发明了BEAMing扩增法,大大提高了ctDNA检测的敏感性。通过将循环DNA与磁珠结合侯进行计数，可以实现万分之一的检测灵敏度。他们使用该法对肠癌患者进行研究，发现能否检出ctDNA与肠癌术后是否复发密切相关，术后仍然能检测到ctDNA的患者基本上都出现了复发，而术后ctDNA水平下降了99%的患者则没有复发。这一结果后来在多种类型的癌症中得到证实。与传统的蛋白标记物如甲胎蛋白（AFP）相比，ctDNA的假阳性要低得多，而且由于其半衰期短，更能实时反映肿瘤情况。后续科学研究发现，在乳腺癌和肠癌中，ctDNA比蛋白标志物更灵敏，可用于追踪肿瘤的消失、转移和复发。也有科学家将ctDNA用于肿瘤耐药的机制研究，发现了新的靶点，同时能够比传统方法更早检测到肿瘤的发生发展情况。

此外，数字化PCR技术也被逐渐应用于ctDNA基因检测。数字PCR技术是一种新型的高灵敏性的核酸片段分析技术，Bio-Rad与Fluidigm公司等目前市场上该技术的主要提供者。Bio-Rad的微滴式数字PCR系统中，每个PCR样本都被分成约20000个微滴，并在这些微滴中进行扩增，每一个微滴都是一个单独的PCR反应体系。数字PCR技术的灵敏度比QPCR技术高10-100个数量级，并且能够对目标进行绝对定量，尤其在复杂背景下的低丰度核酸检测，具有传统PCR方法无法比拟的优势。

Fluidigm相关产品（来自其官网）

在ctDNA应用方面，使用微滴式数字PCR技术检测肺癌和黑色素瘤患者血浆中ctDNA的EGFR、KRAS和BRAF基因突变可实现肿瘤基因的分型，有助于直接监控肿瘤对治疗的应答和耐药进程。在48例复发性黑色素瘤患者中，通过数字化PCR对BRAF和NRAS基因突变进行检测，根据检测结果判断是否使用激酶抑制剂治疗以及可能的治疗效果。在另外一项针对结直肠癌患者研究中，研究者发现利用数字化PCR对HER2基因拷贝数变异检测可以准确判断患者对于药物西妥昔单抗的治疗是否存在抗药性反应。

除了指导治疗之外，在预后评估上，相比传统方法，这一技术也具有显著性优势。在11例结直肠癌患者中，使用数字化PCR进行ctDNA检测，发现这一方法可以提前2-15个月（平均10个月）检测到肿瘤复发，其准确度达到100%。在另外一组针对原发性乳腺癌患者临床试验研究中，采用数字化PCR对PIK3CA基因突变进行检测，发现高浓度ctDNA患者相比低浓度或者没有ctDNA的个体，无瘤生存期以及总生存期均更短；在另外一项回顾性研究中，针对20例乳腺癌患者进行测试，发现平均可以提前11个月检测到复发风险。这些研究显示，使用数字化PCR对ctDNA检测可以用于进行肿瘤预后指导，包括发现早期转移和避免过度治疗等。

但是，这项技术也存在一些不足。例如，在一项胃癌患者研究中，研究者收集了25例患者FFPE组织样本与ctDNA样本进行HER2基因突变检测。研究发现，与荧光原位杂交法/免疫组化法（IHC/FISH）比较，数字化PCR检测中，FFPE样本结果一致性为92%，而ctDNA样本检测结果一致仅有62.5%。这一结果提示我们，ctDNA样本在部分样本中可能还是存在不稳定表现。

《Nature》：解析肿瘤细胞基因组多样性

随着高通量测序技术发展，ctDNA与高通量测序的结合也是技术发展的热点。对热点区域的高深度测序，既可克服ctDNA浓度低的问题，也避免了高灵敏度PCR扩增方法检测区域较小的缺点。此外，由于不需要特定方法进行ctDNA富集，对于肿瘤这种基因组变化极为复杂的疾病，这种新方法在临床上可能具有更好的应用前景。

基于ctDNA的液体活检技术在晚期癌症的预后评估、复发检测、辅助诊断以及治疗应答方面，已经开展了大量的临床应用研究。早在2012年，Nitzan Rosenfeld团队利用目标片段深度测序法，在来自37例卵巢癌患者的62份血浆DNA样本中验证了这一新技术。结果显示，该技术可以有效检测ctDNA基因突变，从而监控肿瘤预后，其结果与数字PCR检测结果高度相符,在发现未知突变方面甚至优于数字PCR技术。

同年，Diaz团队对使用EGFR抑制剂治疗的患者进行ctDNA检测，发现28名患者在治疗过程中有9名出现KRAS基因突变，这一检测可以提前5-6个月判断药物治疗能否有效控制肿瘤病情。

2013年，Murtaza等人跟踪检测了2例乳腺癌、3例卵巢癌和1例肺癌血浆中ctDNA的变异情况，并阐述了EGFR、RB1以及MED1等基因在不同时期药物治疗后的突变情况，提示治疗后监控癌症患者外周血血浆中的基因变异能够指导医生及时发现复发与转移情况并及时调整治疗方案。

2014年，Chetan Bettegowda1团队对640位患者进行了ctDNA的检测，研究发现在胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌以及头颈部癌中，ctDNA的检出率超过75%。他们还针对206例结肠癌患者进行了突变检测，发现KRAS基因突变的检出率达到了87.2%，特异性为99.2%，这提示ctDNA在多种癌症中可以作为一个特异且灵敏的临床生物标记物，应用于癌症诊断和治疗的各个方面。另一项研究发现，肿瘤II/III期患者外周血中ctDNA片段平均含量为8.4%，在IV期患者中含量高达21.8%，研究表明在中晚期患者中，ctDNA可以作为一项比较稳定的标志物，用于肿瘤动态监测。在最近一项针对多种肿瘤临床实验中，针对171例肿瘤患者，采用高通量测序对54个基因进行检测，在99名肿瘤患者检测到ctDNA突变，涉及TP53、EGFR、MET等基因，其中69名患者能根据这些突变找到FDA批准的药物用于治疗。

Foundation Medicine

上述研究采用的技术主要是基于目标区域捕获的测序技术，即通过多重PCR方法或者探针杂交捕获法，对肿瘤相关基因区域富集之后进行超高深度测序。当对于目标区域测序深度达到几百倍甚至上千倍时，可以准确检测出样本中频率低至0.1%的肿瘤基因突变。其中，CAPP－Seq检测方法可以对ctDNA浓度低至0.019%的样本进行准确检测，这一方法在非小细胞肺癌I期患者中检测敏感性达到50%，II－IV期患者中检测敏感性达到100%，特异性均在96％以上。这些基于高通量测序的检测表明其检测灵敏性不亚于传统方法，另一方面，在并行检测基因上具有更大优势。目前专注于ctDNA检测的体液活检公司包括Foundation Medicine，Genomic Health，Guardant Health，Personal Genome Diagnostics和Pathway Genomics等。

国际上，ctDNA检测已经逐步被应用于临床用药指导中。2014年9月，欧盟批准了制药公司阿斯利康的易瑞沙血液ctDNA伴随诊断试剂盒用于非小细胞肺癌患者用药前EGFR突变检测；同年，阿斯利康联合罗氏制药开发的用于支持在研药物AZD9291的血液ctDNA伴随诊断试剂盒也进入了临床试验阶段。不过，其真正应用于临床之前尚有很多工作有待完成。

随着高通量测序产业的日渐成熟以及癌症驱动基因和药物靶点基因研究的日渐完善，基于高通量测序的ctDNA检测技术也日渐成熟，随之而来的就是大量ctDNA测序数据的分析和解读，以及基于上述信息的风险评估和预测模型的构建，这将成为肿瘤液体活检的主要发展方向和竞争领域。

来源：基因空间

作者：王威，遗传学研究员，中科院遗传学博士、同济医科大学医学学士；现任深圳华大基因股份有限公司首席医官。