 分子诊断是将分子生物学原理和技术应用于疾病诊断而产生的一门新兴的检验医学分支学科，是利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物分子和分子体系的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。分子诊断技术深化和扩展了检验医学的内涵和外延。国家精准医疗计划的启动和个体化医学的发展要求，必将持续推动我国分子诊断技术的进步。 一、我国分子诊断的发展概况 我国的分子诊断发展基本上与国外同步，20世纪60—70年代开始萌芽，80年代出现以印迹杂交和限制性片段长度多态性连锁分析为代表的分子诊断技术。20世纪80年代初期中国医学科学院等单位报道完成对α地中海贫血的产前基因诊断[1]。此后，北京、上海和广州等地的一些研究单位开始陆续建立血友病、苯丙酮酸尿症、G－6－PD缺乏症、杜氏肌营养不良等常见遗传病的分子诊断方法。初步建立了以传统PCR技术为基础的分子诊断方法，应用于单基因遗传病、肿瘤、感染性疾病、基因多态性和多基因遗传病等。20世纪90年代中期，由于传统PCR的临床应用不规范，出现大量假阳性问题。这一弊端在90年代后期随着相应法规的严格规范和实时荧光定量PCR技术的推广应用得到了及时纠正[2]。新世纪以来，我国分子诊断技术快速发展并呈现出三个主要发展动向：第一，定量PCR技术的检测开始向高灵敏度和绝对定量检测方向发展，升级版微滴式数字PCR开始崭露头角[3]；第二，高通量测序技术的发展和兴起。目前一代测序仍是金标准，二代测序已经临床实际应用，三代如单分子实时和纳米孔测序技术日臻完善，分子诊断开始从关注单个基因转向关注整个人类基因组。单次测序范围和深度极大增加，测序成本显著降低，直接推动了国内无创产前诊断技术的变革[4]；第三，伴随检测应用提上日程，液态活检技术逐渐被临床医生所认可，体液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体(exosome)等遗传信息载体开始引起人们的重视[5]，血液和尿液等常规体液标本逐渐被赋予新的内容。近年来国内分子诊断的新热点不断出现，尤其在病原体耐药、无创产前诊断、药物基因组检测和肿瘤个体化治疗等领域。 但我国的分子诊断在普及认知程度，特别是规范化开展程度以及医学检验实验室自建检测方法(laboratory developed tests，LDT)发展现状上与国外相比还存在很大差距[6]。为了尽快与国际接轨，各有关部门和分子诊断行业专家做了不懈努力。2015年3月国家卫生计生委医政医管局发布了第一批26家肿瘤诊断与治疗项目高通量基因测序技术临床试点单位名单，卫生部临床检验中心于2015年10月开始开展全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测室间质量评价活动，并要求临床实验室使用日常所用试剂和程序进行检测。同时，相关主管部门也相继积极组织起草了《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范(试行)》、《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》和《肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)》等。 二、分子诊断技术平台和临床应用概况 目前，我国常规开展的分子诊断技术平台主要有流式细胞术、分子杂交技术、DNA测序技术和核酸扩增技术，此前已有非常详细的总结和介绍[7,8]，在此不做赘述。随着我国分子诊断技术平台的逐步完善，分子诊断相关检测应用逐步在各大医院检验科和病理科开展，特别是在检验科感染性疾病、遗传性疾病、药物基因组学和肿瘤个体化治疗等多个检测领域已取得了长足的进步。 (一)感染性病原体检测分型 随着各种病原体基因结构的阐明，利用分子诊断技术能早期、快速、敏感、特异地检测感染性病原体核酸。此外，对耐药菌株的早期检出能够及时准确使用抗菌药物，减少耐药株的产生，同时控制耐药性的传播。在感染性疾病的临床应用方面，采用Luminex xMAP液态芯片、原位杂交、PCR－斑点杂交等技术方法对人乳头状瘤病毒(HPV)DNA检测；采用real－time PCR技术检测结核杆菌DNA、各型肝炎病毒DNA或RNA、人类单纯疱疹病毒(HSV)DNA、淋球菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、生殖器支原体、肺SARS病毒RNA等；采用原位杂交检测EB病毒编码的小RNA；采用PCR结合测序技术快速鉴定高致病性H1N1甲型流感、H7N9禽流感等，这些检测应用已在感染性疾病的诊断及疗效评价方面取得了良好的效果[9]。 (二)遗传性疾病诊断 分子诊断在遗传性疾病的筛查鉴定方面优势明显，通过对患者染色体和基因靶点的检测进行遗传筛查和鉴别诊断，可同时对家族性遗传病的发生进行预测。目前，国内主要通过染色体核型分析、荧光原位杂交技术、real－time PCR技术等检测染色体畸形，辅助产前遗传性疾病的筛查。通过高通量DNA测序、荧光定量PCR等检测相关基因的结构和表达变化，辅助进行生殖系统和神经系统等遗传疾病的诊断。特别是近年来，随着高通量测序技术的发展成熟，出现了基于高通量测序技术的无创产前基因检测(non－invasive prenatal testing，NIPT)技术。目前在临床上成熟应用于染色体非整倍性疾病筛查，主要是21－三体(唐氏综合征)、13－三体(Patau综合征)和18－三体(Edwards综合征)三种疾病的产前筛查[10]。 (三)药物基因组学 对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测可指导临床针对特定患者选择合适药物和给药剂量，实现个体化用药，提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应发生。目前我国食品药品监督管理局(CFDA)已批准了一系列的个体化用药基因诊断试剂盒。根据检测项目所涉及的基因在影响药物反应中的作用机制和被测靶分子(RNA或DNA)的不同，个体化用药分子检测项目包括药物代谢酶与转运体基因遗传多态性检测、药物作用靶点基因遗传变异检测、其他基因变异检测和药物作用靶点基因mRNA表达检测4种类型。应用的检测技术平台主要为第一代测序、焦磷酸测序、real－time PCR和HRM方法等，可开展的药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目主要有：APOE多态性检测、CYP450多态性、TPMT多态性检测、VKORC1－1639 G>A多态性检测、HLA－B位点等位基因检测、ERCC1 mRNA表达检测和TUBB3 mRNA表达检测等[11]。 (四)肿瘤个体化检测 已知的肿瘤易感性基因有APC、BRCA1、RB1、WT1、hTERC和Ras等，分别与家族性腺瘤性息肉、乳腺癌、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、宫颈癌、消化道肿瘤相关。采用DNA测序和real－time PCR等检测相应基因的改变，可评价个体患病风险，进行疾病的早期预防和诊断。通过FISH技术检测染色体数目和结构异常，也可早期发现膀胱癌等恶性肿瘤的发生，筛选肿瘤易感人群[12]。利用FISH技术检测染色体易位及其相应融合基因，如BCR/ABL融合基因、MALT断裂基因和IgH/CCND1融合基因对淋巴造血系统肿瘤分型、治疗药物选择和预后判断具有重要作用[13]。 通过DNA测序、real－time PCR和FISH等技术检测基因扩增、突变、表达和多态性等，能够指导肿瘤靶向治疗。目前应用最为广泛的如乳腺癌HER－2基因扩增与化疗方案选择、EGFR基因突变与肺癌靶向酪氨酸激酶抑制剂(如易瑞沙、特罗凯)选择、KRAS基因突变检测与EGFR抑制剂治疗、EML4－ALK基因融合结合c－Met基因扩增与克唑替尼治疗评价、c－Kit结合PDGFRA基因型预测伊马替尼疗效等。基因表达谱研究在肿瘤分子分型及预后评估方面也起着巨大作用，在乳腺癌应用较为广泛，通过基因表达谱研究可将乳腺癌分为四型，分别是Luminal A型、Luminal B型、Her－2过表达型和Basal－like亚型[14]。通过乳腺癌21基因real－time PCR检测，可评判早期乳腺癌复发风险及化疗获益情况[15]。另外，诸如外周CTC以及ctDNA检测与肿瘤复发与转移等技术也逐步在国内获得初步应用。 三、目前存在的主要问题 (一)检测主体不明确 长期以来，我国的临床分子诊断项目开展的科室主要是经过临检中心评审的医疗机构检验科，都基本建立了比较完善的实验室质量管理体系。检验人员一般都经过规范化培训，有较好的分子诊断相关检测操作质量意识。近年来以个体化治疗为特征的个体化精准医学正快歨走向临床医学的前台，带来了"药物基因组学"和"分子病理学"等概念。于是，近年来相关个体化医学检测在全国众多医疗机构的药学部、病理科、肿瘤科、妇产科、眼科，甚至中心实验室开展起来，状况与20世纪90年代初中期病原体核酸PCR检测情况类似。 (二)从业人员不达标 我国目前在分子诊断相关遗传咨询和伦理审查方面属于空白，遗传咨询师培训滞后，缺乏临床咨询经验。另外，也存在长期忽视基因检测的伦理问题，包括患者遗传信息的隐私保护、分子诊断报告的临床解释与心理咨询辅导等。由于分子诊断对标本采集、处理及质检要求高，标本采集人员应训练有素，实验室检测操作人员除了需要熟练的检测操作技能外，还须具备检测项目与相应临床应用相关的基本知识储备，比如个体化药物治疗检测项目与相应药物临床应用之间的关系。检验医师需要时刻跟踪最新临床科学研究进展，能够分析临床病例实际治疗效果与检测结果之间的关系，具备与临床医师沟通及根据患者情况，提出进一步检测建议和提供相应治疗建议能力。而目前很多临床实验室的从业人员素质不能满足所开展分子检测项目需要。此外，与临床沟通的检验医师匮乏，检验实验室与临床医师根据分子诊断报告进行沟通交流的能力薄弱，造成临床医师对分子诊断的忽视。目前随着二代测序技术在临床的广泛应用，针对临床检测结果进行大数据分析的专业分析人员缺乏明显。 (三)质量监管不到位 由于分子诊断技术方法多样复杂以及国内检测机构多手工操作的这一客观事实，不便于建立统一规范的质量监督体系。开展分子诊断的实验室有些项目的质量控制由本实验室自发进行，缺乏室内质控、室间比对和行业监督；有的项目则根本不进行能力验证。还有的实验室不参加质控项目，这种情况直接影响分子检测项目结果的可靠性和可信度，也是分子检测报告得不到临床重视的原因之一。目前虽然卫生计生委也开展了一些测序项目检测的质控，但参加单位均是出于自愿自觉，对不参加的单位或参加但不合格的单位没有整改纠正措施。建议根据目前实际情况建立全国统一的分子诊断质控体系，制订详细的分子检测项目质控标准和持续改进措施，制定已获行政管理部门批准的体外诊断产品(in vitro diagnostic device，IVD)和LTD监管两条线，由卫生行政部门发布、质控中心和地区临检中心组织实施和监督。考虑到分子检测项目发展迅速这一特殊性，需要进行并及时更新分子检测项目的标准物质制备、能力验证和质控评测，避免长期监督空白。 (四)LDT项目发展不足 受限于我国现有的检验项目注册审批制度和收费管理制度，临床医学检验实验室开展的LDT，无论是数量还是种类都与西方发达国家相距甚远，无法满足临床诊疗日趋增长的个体化与精准化的需求。建议采用试点单位开展和适当质量监管相结合的办法。一方面对国家临床重点检验专科建设单位、通过ISO 15189或CAP认可的三甲医院检验部门局部放开，对于有条件的大型医院医学检验部门逐步放开甚至鼓励适当发展LDT项目。另一方面，实行适当的质量监管，所谓适当即是要充分考虑目前国内LDT发展的现实，如果对"萌芽"状态的LDT参考美国试行过于严格、过度的监管，将可能极大的阻碍医学检验实验室新方法和新技术的应用及发展。可以在及时总结LDT试点单位开展经验的基础上，为LDT在更大范围内的科学合理运用创造条件。在创新发展中科学合理的监管应成为我国LDT监管的新思路和新模式。 (五)收费标准和医保政策滞后 国家卫生计生委已经发布了《医疗机构临床检验项目目录(2013版)》和《非营利性医疗服务项目(2013版)》，其中包含了比较齐全的分子诊断收费项目，各省也颁布了或正在加紧制订颁布自己的收费标准，但是项目收费标准制定相对于分子诊断技术的发展还是显得比较滞后，很多项目比如发展比较迅速的二代测序项目还需要借鉴一代测序项目收费，即使是一代测序项目收费规定也不尽合理，比较笼统，不便于临床实际开展执行。比如上海市只明确了一代测序双脱氧链末端终止测序法600元/测序反应，对于其他测序技术类型收费规定中没有明确具体说明。其次，即使目前有明确清晰的收费标准，医保部门还尚未响应，导至患者存在检测费用的制约，也影响和限制了目前分子诊断应用的健康发展。 四、结语 随着国家政策的不断完善、卫生监督部门对分子诊断重要性认识的不断深入以及越来越多高学历、高素质人才的加入，分子诊断未来仍将会出现革命性的进步。液态活检和单细胞测序将成为未来分子检验的新热点，分子诊断技术将朝着准确、便捷、灵敏、自动化和无创性的方向发展。当前发展阶段仍存在众多问题，解决的关键是在规范各项规章制度的前提下，建立国家和区域标准化分子诊断实验室和标准化实验操作程序。为使我国分子诊断事业朝着健康有序的方向发展，更好的为临床患者提供高质量的分子检测服务，建立分子诊断方法的金标准和标准操作程序，并尽早制定出一个符合中国国情的分子诊断监管体系迫在眉睫。 参考文献略 作者：沈立松 谢国化 单位：上海交通大学医学院附属新华医院检验科 来源：中华检验医学杂志 |
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