 自2010年起，恶性肿瘤已成为我国第一大死亡原因。2015年我国恶性肿瘤新发病例数占全球新发恶性肿瘤患者的22%，死亡病例数占全球恶性肿瘤死亡患者的27%。如何控制恶性肿瘤的发生和发展已成为重点研究方向。病理诊断是恶性肿瘤诊治的前提和基础，穿刺或手术活检是确诊的常见方法，但这种有创性的操作限制其重复开展；而对于前列腺癌骨转移、胰腺癌等患者，转移灶的取材难度也限制了活检的应用。因此，对复发转移的恶性肿瘤患者目前大多采用初始的病理结果指导治疗，并无法进行多次动态监测。随着技术的进步和精准医学的发展，微观水平的研究对以往临床治疗观念形成了很大的冲击，一系列可用于指导治疗的生物学标志在同一患者体内并非完全一致，很可能在细胞之间或原发灶与转移灶之间呈现着不同的状态，并随着疾病的进展而改变。这种肿瘤异质性对治疗有着巨大的影响，如何实时动态地获取准确的病理指标已成为精准医学模式下的重要研究内容。 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是指从恶性肿瘤原发部位脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的细胞，它能够反映肿瘤组织情况，也可以用无创方式替代组织样本进行病理诊断、疾病监测、分子测序等，不仅可以动态监测，还可以用于判断预后。 CTCs捕获技术的发展与优化 1869年，Ashworth TR在对乳腺癌广泛转移患者进行尸检时，首次探查到CTCs细胞。尽管研究者希望能够从这种新发现的细胞中获取更多的信息，但由于技术的限制，无法从活体中捕获这类细胞，只能通过回顾性研究，将其作为一种可以与短期疗效相关的肿瘤标志物应用于临床。 随着对CTCs产生机制的深入了解，出现了众多CTCs的检测方法，但各有利弊。最有代表性的是美国强生公司研发的Cellsearch系统。研究者发现CTCs表面特异性表达上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，利用EpCAM可以很好地区分循环系统中的正常细胞和肿瘤细胞。Cellsearch系统即利用EpCAM与包含特异性抗体的磁珠结合，在外加磁场的作用下会发生分流的原理，达到分离提纯CTCs的目的。Cellsearch作为目前唯一经美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于检测CTCs的平台，其优势包括系统半自动化，检测迅速，重复性好，同时具备高特异度的优点，但受抽血量的限制，很难获得大量CTCs。而对于一些CTCs数量本身就少的肿瘤，如非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)，如何提升捕获率对后续研究尤为重要。为了避免抽血量对CTCs数量的影响，研发者开发了可将采集器置于血管内的技术平台，将涂有EpCAM的功能层置于血管内30 min，约1 L血液可以通过收集装置，可收集到大量的CTCs。对185例NSCLC患者进行检测的结果显示，58%的样本采集到>1个CTCs(均值为5个CTCs)，而Cellsearch的检出率仅为27%，同时通过剪切采集器可以获得单个CTCs，便于CTCs的后续研究，这也成为有别于Cellsearch的一大优势。 有研究显示，CTCs从组织进入血液传播会发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，造成CTCs表面上皮源性基因表达下调，而间质源性基因表达上调，从而导至肿瘤发生转移、耐药和免疫逃避等。现有的采集方式均是以上皮来源的EpCAM作为主要的捕获工具，这将影响EMT细胞的捕获，导至假阴性率提高。为此，有学者将间质特异性抗原纳入检测系统，结果显示，利用Cellsearch检测晚期乳腺癌不同治疗阶段的CTCs时，其灵敏度和特异度仅为47%和83%，而加入间质特异性抗原后，其灵敏度和特异度分别为85%和94%，均有很大提升。所以，了解不同CTCs表面抗原特性，定制不同的采集装置可以捕获不同类型的CTCs，提高检出率。 由于CTCs数目稀少，在每1 ml血中仅存在1～10个CTCs，却含有大量的正常细胞，尤其是白细胞的存在会影响最终的结果判读。因此，在如何保证高灵敏度的情况下提高特异度，从正常细胞中筛选出目的细胞，成为CTCs技术发展的必要前提。不管是正性富集，如依靠EpCAM识别循环上皮细胞，还是通过负性富集删除大量血细胞，都是依靠抗原-抗体亲和力进行捕获。考虑到CTCs表面抗原可能消失或者无法与功能区充分结合，依靠亲和力捕获的技术仍存在敏感度不高的缺陷。有学者利用CTCs或血细胞的自身特性，如不同的密度、大小、电荷等，辅助分离出CTCs。如Parsortix系统即根据肿瘤细胞的大小和多形性进行分离收集，其捕获率能够达到42%～70%。根据物理特性分离的CTCs，其优势除了避免不同抗原对结果的影响，还能够收集到形态更好的肿瘤细胞，方便后续研究。 总之，目前仍缺乏有效的CTCs检测标准，尽管Cellsearch仍是目前CTCs检测的金标准，但已逐渐显示出技术缺陷。我们相信，随着各种技术平台的研发，将会填补Cellsearch技术的空白，促进CTCs研究的发展。 CTCs的研究现状与进展 捕获技术的发展是CTCs研究的前提条件，正是因为捕获技术的进步，我们才能够分析肿瘤细胞的数量，研究肿瘤细胞的表型和基因型。 1．CTCs的计数与预后： 肿瘤治疗的最终目标即达到病理完全缓解，但根据Fisher理论，肿瘤是一种全身性疾病，经过治疗后，即便实体肿瘤可以完全缓解，但仍有机会存在残余病灶，这是肿瘤复发和转移的主要原因。CTCs在肿瘤的复发和转移中扮演着重要角色。2004年，有学者利用Cellsearch平台对晚期乳腺癌患者进行CTCs检测，明确了CTCs>5个时，患者的预后较差，同时CTCs也显示出较传统影像学检查更为可靠的结果。随后在诸如结肠癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤患者中也进行了一系列试验，并显示出同样的结果。这些结果提示，CTCs不仅可以作为一种提示肿瘤存在的分子标志物，还与患者的生存预后密切相关，在预测肿瘤患者的疗效和预后方面发挥重要作用。 2009年，作为首批引入Cellsearch技术的单位之一，我们即开始利用CTCs研究恶性肿瘤患者的预后。由我中心牵头的前瞻性试验CBCSG004(China breast cancer clinical study group)结果显示，在中国转移性乳腺癌患者中，当CTCs数量≥5个时，预后较差。不仅如此，我们在后期的随访过程中也发现，治疗过程中CTCs数量下降明显的患者也可以获得较好的无进展生存时间(progression-free survival, PFS)或总生存时间(overall survival，OS)。因此，治疗后的CTCs数量也是影响患者生存的独立预测因子。同时，在不同分子分型的肿瘤中，CTCs代表了不同的含义。如激素受体阳性乳腺癌患者仅在基线水平时的CTCs数量与预后有关，而治疗后的CTCs数量与预后无关；三阴性乳腺癌患者仅有治疗后的CTCs数量才有预测预后的作用；HER-2阳性乳腺癌患者任何阶段的CTCs数量均可以预测预后。 CBCSG004研究的意义在于，它不仅验证了国内乳腺癌患者CTCs与预后的相关性，了解了CTCs动态变化能够预测患者疾病进展风险的改善，为CTCs在国内的广泛应用奠定了基础；同时还发现CTCs在不同分子分型下可以代表不同的预后意义，促进了后续利用CTCs进行分子分型研究的开展。 当然，肿瘤的治疗是漫长的过程，在关注宏观肿瘤变化时，我们也应该关注肿瘤的微观变化。目前的CTCs计数均集中于晚期治疗阶段，这是因为晚期阶段患者肿瘤负荷较大、病情复杂，很容易捕获CTCs，并监测后续病情变化。但随着CTCs捕获技术的不断进步，目前在早期患者中同样也可以检测到肿瘤细胞，随着肿瘤治疗进入早治疗和早预防阶段，我们更应该将CTCs引入到早期阶段，以便于监测肿瘤残余。而对于CTCs检测具有高危复发风险的患者，更应定期监测，并进行密切随访，及早预测肿瘤的存在及其进展，以便及时得到治疗。 2．分子分型指导治疗及提示预后： 目前，仅局限于CTCs计数的研究已经不能满足临床需要，利用CTCs还可以研究蛋白质组学或基因组学的相关信息。如人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)扩增、点突变、DNA甲基化等。根据CBCSG004研究显示的不同分子分型乳腺癌患者的预后不同，我们探讨了利用CTCs分子分型预测治疗疗效的可行性。若将>30%CTCs中的HER-2扩增定义为CTCs HER-2阳性，则CTCs HER-2阳性与组织中的一致率仅为48% 。后续的研究也显示，HER-2状态的不一致率可能与检测的间隔时间有关，间隔时间>1年的患者不一致率更高。此外，CTCs HER-2阳性患者的PFS明显优于阴性患者(分别为8.5和3.5个月，P<0.001)，CTCs HER-2状态可以作为PFS的预测因子之一(HR＝0.383，95%CI为0.166～0.831)。因此，利用CTCs实时动态判断HER-2状态，不仅可以评估患者的HER-2真实状态，同时在评估肿瘤异质性方面也将发挥重要作用。对于组织学HER-2阴性的患者，如果能检测到CTCs HER-2阳性，有可能增加患者治疗的机会。再结合CTCs HER-2检测结果、组织学状态和HER-2细胞外段信息，可以更为经济、简便地监测患者的预后。 此外，考虑到CTCs数量的变化可以有效预测药物疗效，我们还可以利用分子分型将CTCs标记为不同类型，检测治疗过程中不同类型CTCs的变化，从而监测疗效，辅助临床调整治疗意向。如前列腺癌特异抗原和前列腺特异性膜抗原分别会在雄激素受体活化和抑制过程中表达上调，因此通过检测CTCs表面前列腺癌特异抗原或前列腺特异性膜抗原可以很好地预测抗雄激素的治疗疗效。 尽管如此，利用CTCs的分子分型在原理上还存在一些问题：如进行分子分型时需要分离CTCs，但目前分离技术的敏感度和特异度还有待进一步提高；其次，目前并没有很好的理论解释CTCs间的异质性是由于技术原因导至的假阴性，还是本身就存在；此外，与单纯计数不同，在原有EpCAM染色的基础上继续选择后续的染色蛋白，在染色技术上就会有严格要求，且增加了额外费用，目前国内尚无法广泛开展。 但是随着分子分型理念下个体化治疗的不断深入，依照疾病的生物学行为进行治疗成为众多医疗工作者的选择，这将对病理诊断有更为严格的要求。不管是肿瘤在治疗过程中发生分子分型改变或是因为肿瘤异质性导至活检时评估不足，对肿瘤信息的准确获取是后期治疗的前提，仅用一次检测结果即决定后续的全部治疗，将严重影响后续治疗方案的有效性。为此，利用CTCs实时动态检测分子分型的变化，调整治疗方案，同时监测药物疗效，必然会在临床受到重视和推广。 3．CTCs基因分型与测序： 从CTCs计数到分子分型可以很好地诠释医学模式从群体治疗走向个体化治疗的变化。但随着精准医学时代的到来，恶性肿瘤的治疗不能仅局限于分子分型的个体化治疗时代，如果利用CTCs进行分子分型是从蛋白组学水平了解肿瘤情况，那么以高通量测序及大数据为平台的精准医学，可以让研究者有更多机会从基因组或转录组水平探究肿瘤内部机制，了解发病原因及耐药机制，甚至有机会预测耐药的发生。 目前，利用组织进行二代测序已经得到了较好的发展，但由众多肿瘤细胞组成的组织测序，其结果也仅代表这些肿瘤细胞恶性程度的均值。肿瘤的侵袭、复发和转移均是由极少量的肿瘤干细胞引发，如何区分真正有科研价值的肿瘤细胞，并进行后续分析，这是精准医学的目标所在，而利用CTCs进行单细胞测序，可以清楚分辨肿瘤的全部细胞亚型和状态，是肿瘤研究的理想方法。 利用CTCs进行单细胞测序的技术瓶颈在于：单个细胞内存在的遗传物质含量极低(<10 pg)，如要完成基因测序，需通过全基因扩增来获得足够的遗传物质。目前的基因技术很多，包括各种PCR扩增、多位点置换扩增(multiple displacement amplifica-tion，MDA)等。由于DNA测序只含有一条初始链，如何确保测序的高保真度以及高覆盖度成为测序技术的关键。尽管PCR技术能够获得高度一致的扩增产物，但其覆盖度较低，因此只适合长度<60 kb的检测，而MDA技术尽管改善了基因覆盖度问题，但其应用于拷贝数变异时仍然存在一定的假阳性率。国内学者研发的多重退火环装循环扩增技术(multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC)结合了PCR和MDA的优势，具有基因组扩增均匀、覆盖率高等众多优势，从而使得研究人员可以在单个细胞水平准确探测拷贝数变异和单核苷酸变异。利用这项技术可成功实现肺腺癌和小细胞肺癌患者的CTCs检测，并发现与恶性肿瘤发展关系密切的原癌基因和抑癌基因上的重要单核苷酸变异以及插入或缺失。 目前对CTCs进行单细胞测序主要包括DNA测序和RNA测序。DNA测序可以获得完整的基因组信息，能够深入了解肿瘤细胞的增生、抗药物作用能力，同时可以通过绘制细胞谱系，阐述肿瘤的演进过程，了解驱动基因的产生和分布情况。利用RNA测序可以分析细胞的类型和状态、基因的表达和调控等，从转录组水平分析肿瘤的信号通路、增殖过程、免疫反应，同时在探讨肿瘤内异质性和肿瘤干细胞等问题上也将会发挥重要作用。当然，大量基因片段也会增加研究者的分析难度，针对性分析某些基因片段(如HER-2突变基因)不仅可以节省费用，同时还能够获得较高的测序深度，辅助临床医师在追踪肿瘤的演化、引导肿瘤的治疗、监控肿瘤的复发中发挥重要作用。 单细胞测序技术在辅助生殖、微生物检测中已经有了较大发展，而以CTCs进行DNA或RNA测序也显示了重要的应用前景，但目前仍存在费用较高、基因扩增技术标准不统一等问题。考虑到测序能更深入地了解肿瘤内部结构，揭示基因的突变和通路的活化机制，为肿瘤治疗带来极大获益，因此我们相信，未来在测序方面会有更多的进步，而这也是我们中心未来关注的重点之一。 目前，CTCs检测在肿瘤早期诊断、了解肿瘤转移进程及判断患者预后中有了长足的发展。但单个细胞能否反映异质性极强的肿瘤情况，尤其是如何寻找"优势突变"亚群仍是CTCs发展的瓶颈。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)来源于死亡肿瘤组织碎片，更能反映整个肿瘤组织情况，在监测肿瘤负荷、药物疗效、预后分析等方面具有潜在的临床应用价值。 然而ctDNA半衰期短，正常的DNA碎片会干扰其结果，同时ctDNA的自身特性决定了其不能提供细胞形态学、免疫组化以及抗原表位等信息，也无法全面了解一类细胞的突变情况，从而无法探究肿瘤异质性或克隆进化过程。而CTCs不仅可以弥补以上缺点，还可以利用活体实验探究肿瘤转移的生物学途径。 未来的精准医学必然会结合CTCs在分子分型、测序以及ctDNA高灵敏度、高信息率的优势，在肿瘤的诊断、治疗、预测疗效等方面发挥作用。目前，液体活检中捕获CTCs及测序技术已有突破性进展，如何继续把握时代前沿，同时促进肿瘤防治事业的发展是未来一段时间的重要课题，也是重要的发展方向。 作者：李健斌 江泽飞 单位：军事医学科学院附属医院乳腺肿瘤科 来源：中华肿瘤杂志, 2016,38(12): 881-885. 肿瘤医学论坛综合整理 |
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