 图 ：CTC 原理图 随着实体肿瘤的生长，周围微环境发生了特定的变化时，有一部分肿瘤细胞会获得异常的活动能力（上皮间质转化，EMT）。这些细胞从原发肿瘤上脱落，在身体里寻找新的落脚点。这些肿瘤细胞会搭乘血液系统或淋巴系统去往身体各处，其中经过血液循环的脱落肿瘤细胞就被称为循环肿瘤细胞（CTC, Circulating Tumor Cells），在到达适宜的目标时他们又会变成恶性繁殖的机器（间质上皮转化，MET）。这就是肿瘤的血行转移，从原发部位形成继发性肿瘤。  图 ：CTC 检测流程图 想从血液中找到这些细胞难度非常大，每毫升血液里面CTC 是个位数，而白细胞的数量级是106-107，红细胞的数量则更多。我们就拿白细胞与CTC 计数做对比，健康人群的白细胞计数下限是每毫升4 百万个。四大名著基本上每本都在100 万字左右，粗略的计算一下：想从大量血细胞中找到CTC 细胞的感觉，和从四大名著中挑出一个错别字的感觉差不多。当得到患者的血液后，首先需要进行CTC 的分离和富集，然后对这些分离的细胞进行蛋白水平或者基因水平的分析，然后分析这些CTC 的特性，给出治疗策略。就目前的技术发展而言，由于CTC 数量稀少，个体异质性高，细胞的富集和检测是当前面临的最大的技术瓶颈。下文中，我们将从技术角度分析CTC 检测领域的技术发展。 CTC 检测的发展历程  图 ：CTC 的发展历史 1869 年，CTC 首次被提出。澳大利亚籍医生Ashworth 发现一名已死亡的男性转移性肿瘤患者血液中存在的一些血细胞同尸检发现的肿瘤细胞相似，首次提出循环肿瘤细胞的概念。 1889 年，肿瘤转移中发现CTC。英国外科医师Steven Paget 进一步提出了一个“种子与土壤”的假设，指出肿瘤可能通过向血液中释放CTC 进行转移。 1976 年，Nowell 将CTC 的定义修正为：来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。 2003 年，肿瘤细胞形成过程中的EMT 被发现。Hook 和Keller 在胚胎发育中观察到上皮皮间充质转化（EMT），CTC 关键概念才得以阐述。EMT 使上皮细胞丢失上皮细胞的表型，获得某些间质细胞的表型，从而有能力入侵通过周围的基底膜。 2004 年，第一款CTC 检测仪器Cell Search，获得美国FDA 批准。 2013 年，原发肿瘤细胞与CTC 具有相同的变异谱。Heitzer 利用单细胞测序技术发现CTC 与原发或转移肿瘤组织存在相同的基因变异谱，为CTC 作为肿瘤替代性样本奠定了最终的基础。 2016 年2 月，CFDA 批准第一个CTC 检测试剂盒--叶酸受体阳性CTC 检测试剂盒（肺癌CTC 检测技术）。 CTC 富集方法  图 ：CTC 富集方法分类一览 表 ：常用CTC 富集技术比较  人体循环系统中CTC 的含量极低,肿瘤转移患者每毫升全血中仅有1～10 个CTCs，因此要实现CTCs 的检测对其进行分选富集是一个必不可少的步骤。CTC 分选富集效果的优劣将会直接影响其后续的检测(计数、基因扩增、基因测序等)效果,因此高纯度、高灵敏性(不丢失CTC)、快速、高细胞活性的CTC 分选富集是CTC 临床应用的重点和难点。 CTC 的富集方法可以分为化学特性富集法（免疫亲和）和物理特性富集法。免疫亲和法主要是根据CTC 表面表达的特异性的蛋白将CTC 筛选出来，物理特性富集主要是根据CTC 的大小和密度等特性将这些细胞筛选出来。 1、 生物化学特性富集法 建立在CTC 生化特性的分离富集方法，主要是利用特异性抗体与细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC，或者去除血细胞留下肿瘤细胞。主要包括包括：阳性富集法，阴性富集法，微流体法和体内富集。
（1）阳性富集法（免疫磁珠吸附CTC）：以Cell Search 为代表，在磁珠上包被细胞表面粘附分子EpCAM，来捕获CTC。
（2）阴性富集法（免疫磁珠吸附其他细胞）：也称为白细胞去除法。用特异性抗体CD45，CD14 等与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。该方法比其它富集方法捕获效率更高，但特异性明显低于其它方法。
（3）阳性富集法（微流体法）：将抗CTC 表面特定蛋白标示物(EpCAM)抗体与磁珠或微流体进行偶联，利用这些固相载体上的抗体直接从血中捕获CTC。 物理特性富集法：依据CTC 的物理特性，如密度、大小、可变形性及表面电荷等进行富集。
（1）密度梯度离心：非常廉价高效的CTC 分离方法，可将CTC 与白细胞和红细胞分离。目前市场上有较多的依赖密度梯度离心进行CTC 富集的试剂盒，如Ficoll-Paque solution（Pharmacia Fine Chemicals，Sweden），OncoQuick（Grenier BioOne, Germany）等。临床实验证明，密度梯度离心富集CTC 比Cell Search 系统效率更高。 （2）过滤法：依据CTC 体积大于血细胞的特性，对CTC 进行捕获。CTC 的直径约为10um-20um，而血细胞大小为7-12um，通过过滤，留下体积比较大的CTC。然而随着近年来人们对CTC 了解的不断加深，发现很多CTC实际上与白细胞一样大，有些甚至只有白细胞的一半或更小。目前有证据显示，这些小或超小CTC 的数目比例在有些瘤种中可高达1/3。 （3）微流控芯片：针对CTC 的体积和可变形性对CTC 进行捕获，CTC 的捕获率和特异性均可达到80%以上。 总的来说物理特性富集法中密度梯度离心和过滤法操作简单，成本低廉，不依赖细胞表面抗体的表达，捕获的细胞数量多，能够克服CTC 在蛋白表达上的异质性，但是无法克服CTC 在物理特性的异质性。生化特性法操作复杂，成本相对更高。未来，两者结合的微流控芯片将是CTC 分离富集发展的趋势。 CTC 富集技术的瓶颈 表 ：CTC 基于表面标记物捕获的准确率分析  总的来说，基于CTC 的生化特性的CTC 富集方法依赖于细胞表面抗原的表达情况。从上表可以看出，由于肿瘤的异质性，很多肿瘤标志物特异性并不高。例如对于EpCAM 法来说，肺癌，前列腺癌，卵巢癌的富集效果好，但是胃癌，肠道癌的富集效率就很低。对于阴性富集法而言，由于只是去除了阳性细胞，CTC 纯度不高。  图 ：血液中不同细胞的大小  图 ：CTC 体积差异大 基于物理特性的富集法同样存在肿瘤异质性的问题，我们可以看到，肿瘤细胞的大小并不均一，从12uM-25uM不等，而且有些血细胞的大小也在这个范围内，仅通过物理特性，难以富集到高纯度的CTC。目前有证据显示，这些小或超小CTC 的数目比例在有些瘤种中可高达1/3。人们对于这些小的CTC 显然不能视而不见。实际上有关过滤法灵敏性较低的客观评价国外已有多篇报道，而这些小CTC 的特殊重要临床意义也已经引起了人们的密切关注(Coumans,et al., Ann. Oncol. 21:1851,2010）。 从上文的分析可以看到，不论是基于生化特性还是物理特性的CTC 分离富集技术都存在一定的问题，未来还有很大的技术提升空间。两者结合的富集技术可能是未来的发展方向。 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
