液体活检之ctDNA：检测分析方法多，但缺乏标准

　　这种血液中的DNA微小片段是一种新的潜在肿瘤生物标志物，即循环肿瘤DNA（ctDNA）。早在1948年MANDEL在正常人群的血液中检测到游离DNA片段，即血浆游离DNA（cfDNA）。直到几十年后，LEON等发现肿瘤患者体内cfDNA高于健康个体，且晚期肿瘤患者cfDNA水平更高。这些研究提示cfDNA与肿瘤关系密切，并与肿瘤转移相关性高。随着研究的不断深入，学者发现cfDNA中存在与肿瘤基因改变相同的DNA片段，并命名为ctDNA。肿瘤学家维克多·威尔卡斯卡在接受《自然》杂志采访时指出，ctDNA是一些从肿瘤细胞逃逸至血液中的DNA片段，它们可提供帮助我们监测和分析疾病的基因线索。尤其是当我们不能对组织活检时，不论在治疗的开始阶段，还是治疗过程中对病人的监测，ctDNA检测的线索都弥足珍贵。

　　目前，相关的研究正处于临床应用阶段。其中一项应用正在对晚期癌症进行观察。临床上，很多病例难以获取肿瘤组织标本，因此无法对肿瘤组织进行直接分析。而通过检测血液中的相关指标就显得更有意义（液体活检）。在大肠癌研究过程中发现，通过检测患者血液中的HER2/neu受体——该受体是曲妥单抗的作用靶点——发现一小部分结肠癌患者具有显著扩增的HER2/neu。其他正在进行中的临床研究，将有助于判定HER2/neu是否可以为结肠癌治疗的作用靶点，以及能否为这些患者提供更多治疗选择。

　　检测和分析ctDNAd 方法很多，但缺乏统一标准，这在陈岳青等研究cDNA与非小细胞肺癌的关系中得到进一步证实。因此我们需先解决一些问题。第一，分析前的分离程序需要标准化。首先，收集样品到分离血的时间间隔，离心条件，确定用血清还是血浆分析；然后，如何分离出足够高质量的DNA。第二，ctDNA的定量标准化。量化的方法包括分光光度计、荧光染料、定量PCR等。第三，cfDNA的检测过程中存在3个难点，ctDNA与正常cfDNA有何区别、ctDNA低水平状态如何检出和样品中突变片段数怎样准确定量。研究显示虽然血清中ctDNA的量比血浆中高2~24倍，但血浆更适合于用来分析ctDNA，其原因可能是凝血过程中细胞产生的某些物质影像分析。cfDNA发生基因突变后称为ctDNA，1994年首次提出了cfDNA上的体细胞点突变区域。这些体细胞突变通常来源于单个碱基替换，只在癌细胞或癌前的基因组细胞中存在，这保证了ctDNA作为生物标记物的特异性。因此，肿瘤DNA片段丰富的癌症患者的循环中，可以用标识体细胞突变DNA测序方法来明确ctDNA。肿瘤细胞中核酸突变包括点突变、扩增、成排、DNA甲基化、线粒体DNA突变以及非整倍体，其中以点突变发生率最高，如EGFR和KRAS突变。很多情况下，cfDNA在循环中浓度低且碎片率高，这给分析带来了巨大的挑战。随着数字基因组技术的发展，数字聚合酶链反应技术，PAP和TAM-Seq的出现大大提高了检测ctDNA的敏感性。

　　通过大量临床肿瘤试验的研究，ctDNA作为液体活检的功能逐渐被人们认知。然而将液体活检正式用于临床实践前需要大量前瞻性临床研究进行验证，且应对其分离检测及分析过程的每个环节进行标准化。此外，ctDNA释放的动力学机制尚未完全阐明，所以在治疗过程中应检测同一癌症患者不同实践ctDNA的浓度以便动态了解疾病情况。