循环肿瘤DNA的突变跟踪对早期乳腺癌患者复发的预测

共55名早期乳腺癌患者（术前接受过辅助化疗）参与本次前瞻性研究。文章明确提出了“突变跟踪”（mutation tracking）的概念：连续收集（术后每6个月采集一次血样）早期乳腺癌患者术后的血浆样本，采用数字PCR方法对ctDNA中的突变位点进行检测，并通过log-rank检验分析ctDNA突变与无疾病生存率的相关性，进而验证通过ctDNA的突变跟踪进行早期乳腺癌患者肿瘤复发预测的可行性。方法学层面还是日渐清晰、逐渐成为“定式”的NGS和dPCR的联合使用，总体技术路线见下图。

从术前的活检标本中提取得到肿瘤DNA，利用Ion AmpliSeq Breast Cancer Panel对已知的14个乳腺癌驱动基因进行突变分析。结果显示78%（43/55; 95% CI）的患者中至少存在1种突变，12名患者中至少存在2种突变。

为了鉴定和跟踪血浆中的ctDNA，研究人员采用了超灵敏的数字PCR技术对不同突变位点进行分析。下图2A中对55个位点的分析显示，MPS和dPCR对肿瘤DNA突变位点的检测结果高度一致，互证了两种方法对不同突变位点检测结果的可靠性。下图2B中对9名患者17个突变位点的数字PCR分析显示，该方法对突变的检测具有良好的重复性。

利用dPCR分别检测术后2~4周和随访期间（每6个月取样一次）收集的连续血液样本中ctDNA突变，检测的突变位点是PIK3CA c.3140A>T。见上图2C，患者A310001术后连续收集的血样中均未检出突变，说明手术和辅助化疗成功清除原发病灶，术后的30个月内未见复发；相反，患者A310006 PIK3CA c.3140A>T的丰度在术后6.2个月时显著上升，预示着存在MRD，术后8.1个月肿瘤全面转移。接着，研究人员评估不同取样时间点血浆中ctDNA对预测复发的影响。

首先，考察术前未经任何治疗的患者血浆中ctDNA的基准水平。其中69%的样本发现ctDNA（29/42; 95%CI），此阶段ctDNA的水平与患者疾病恶化程度有关，例如组织学分级、雌激素受体阴性等，而与病灶大小无关。但是，基准ctDNA的检测不能预测患者无疾病生存期，而且ctDNA的含量与肿瘤的转移复发也不存在相关性。分析结果见下图。

其次，考察术后单一时间点血样与连续收集血样条件下的突变跟踪对肿瘤复发预测的影响。对于2~4周的单一血浆样本，19%患者检测到ctDNA突变（7/37; 95% CI），突变丰度差异较大（平均值19.2 copies/ml，1.8~6,284 copies/ml）。结果证实术后2~4周单一时间点采集的血浆样品ctDNA的突变能有效预测肿瘤的复发。对于连续收集血液样本ctDNA的突变跟踪同样可以预测肿瘤后期的复发。分析结果见下图。

考虑到术后单一时间点采样样本ctDNA的检测将受到患者自身的限制，最好能进行连续采样条件下血浆的ctDNA突变跟踪。在随访复发的患者中，术后单一采样样本ctDNA的阳性率为50%（6/12），进行连续采样血液ctDNA突变跟踪的阳性率为80%（12/15）。在未复发的患者中，96%的患者在上述两种情况下皆未检测到任何ctDNA突变。

ctDNA的检测较临床诊断复发的中位时间提前7.9个月，能准确判断MRD的存在，这是传统影像学检测难以企及的。对于早期复发的乳腺癌患者，在连续采样条件下血浆的ctDNA突变会持续存在，这就为通过ctDNA突变跟踪进行肿瘤复发的预测提供了可能。下图中，12名颅外MRD全部通过ctDNA的检测实现了预测，患者出现了复发。另外3名患者的转移灶在脑部，与之前的研究结果一致：神经胶质瘤无法在患者的血液内检测到对应的ctDNA。（看到这里，陈斯卡自然有了第一个疑惑：那么如何对脑部肿瘤实现ctDNA的连续突变跟踪？）

肿瘤患者治疗的一大难点在于肿瘤组织本身的异质性，肿瘤本身在治疗过程中不断发生变化，乳腺癌也不例外。通过上面的介绍我们已经明确通过血液中ctDNA的检测能够作为肿瘤复发的早期预测手段。进一步，本研究希望通过对MRD患者血浆ctDNA的深度测序来解析肿瘤患者原发灶及转移灶在基因组水平的变化。

总共有5名患者参加了此项测试，每名患者测序的样品设置如下：原发灶、复发前的血浆ctDNA及转移灶的活检组织。深度测序在HiSeq2000上完成，对乳腺癌复发相关的273个基因的外显子进行测序。

患者A310003的ctDNA测序发现存在PIK3CA突变，这与原发灶和转移灶保持一致。然而，血浆中ctDNA相关突变位点的改变更加接近复发后活检标本的结果。例如ctDNA测序发现FGFR K656E突变的存在，它仅仅存在于转移灶而未现于原发灶。测序结果、ddPCR及Sanger测序的验证结果见下图所示。

患者A310035的ctDNA测序发现了SYNE1 S1244Y突变、GATA3移位突变和STAT3缺失突变，这些通过血浆ctDNA测序发现的突变和转移灶活检标本测序的结果一致。测序结果见下图所示。

患者A310004的转移灶活检样本测序后发现RB1 R320*突变，但在血浆ctDNA中未检测到该突变（取样时间是复发前6.1个月）。通过数字PCR分析显示在术后16.1个月的血浆ctDNA中发现该突变，随后突变丰度逐渐增加，说明RB1突变是肿瘤复发过程中的晚期事件，而ANK3和XIRP2位点的突变则属于早期突变事件。结果见下图所示。

此外，在患者A310004和A310012中，通过血浆ctDNA深度测序还分别发现了HER2和MDM2基因拷贝数的变化，并且与原发灶的结果一致。可见在肿瘤的遗传学水平，除了点突变之外，基因拷贝数的变化也是肿瘤的驱动事件之一。（陈斯卡又有了第二个疑惑。）测序结果见下图。

总体而言，伴随着肿瘤的发生与治疗，肿瘤的遗传学特性不断发生改变，而通过血浆ctDNA的“突变跟踪”能够在肿瘤复发之前准确分析MRD的遗传状态，为肿瘤的治疗及微小残留病变提供分子层面的监控手段。

看点1：血液中ctDNA的检测可分为“静态”和“动态”两种方式。前者对应本研究中术后的单一时间点采样，后者对应术后的连续血样检测。尤其是后者，能实时反映肿瘤遗传学水平的变化，更贴合“精准医疗”的概念。

看点2：展示了在早期乳腺癌患ctDNA突变跟踪中NGS和dPCR的联合应用。

看点3：循环肿瘤DNA的检测能够对早期乳腺癌患者的复发进行预测。