谈临床微生物检测

2016-1-10 23:27| 编辑: 小桔灯网| 查看: 4233| 评论: 0|来源: 《医学仪器与试剂》

摘要: 《医学仪器与试剂》（以下简称“医”）：看过您一篇关于临床微生物快速诊断技术的发展文章，能不能请您在这里简单谈一谈目前分子生物、芯片、质谱等最新技术在微生物检测中发挥的作用？在您的科室里有没有一些案例说 ...

《医学仪器与试剂》（以下简称“医”）：看过您一篇关于临床微生物快速诊断技术的发展文章，能不能请您在这里简单谈一谈目前分子生物、芯片、质谱等最新技术在微生物检测中发挥的作用？在您的科室里有没有一些案例说明这些技术的应用情况？
近年来造成人类感染的病原微生物日益复杂,急性呼吸窘迫综合征、高致病性禽流感、埃博拉出血热等新发和突发传染病的不断涌现，一些传统的病原微生物如结核分支杆菌、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌等死灰复燃,而且耐药性不断增强，给临床诊断和治疗带来了极大的困扰，同时全球化带来了人口大规模流动，增加了传染病的防治难度。传统的病原微生物检测技术操作繁琐、周期较长，且特异性不高，难以满足临床诊疗的需求。随着科学技术进步，人们利用分子生物学、生物传感器、生物芯片、质谱等技术快速检测临床标本中的病原微生物，为突发传染病的早发现、早诊断、早隔离和早治疗提供科学依据和决策。
随着分子生物学技术的迅速发展，人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平，对于那些难培养和不可能培养的微生物，可直接通过获得基因信息而快速、准确检测细菌、支原体、衣原体、真菌、病毒等病原微生物。常用的分子微生物学技术包括：DNA-DNA杂交技术、核酸探针技术、核酸扩增技术、环介导等温扩增技术等。
生物传感器是基于生物化学和电化学反应原理，将生化反应信号转换为电信号，通过对电信号进行放大和模数转换，测量出被测物质及其浓度。目前常用的生物传感器主要有酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器、场晶体管传感器等，具有准确、操作简便、高度自动化、微型化与集成化的特点，近年来已经在感染性疾病诊断、药物筛选、生物武器监测等领域获得了广泛的应用。
生物芯片是20世纪90年代中期发展起来的一项技术,在玻片、尼龙膜等载体上固定基因片段、多肽、蛋白质、糖分子、组织等高通量生物信息分子，然后与带荧光标记的DNA、蛋白质或小分子等样品进行杂交，检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，从而实现对核酸、蛋白质及其他生物成分的高通量快速检测。根据芯片上固定的生物活性分子的不同分为细胞芯片、组织芯片、蛋白芯片和基因芯片，可广泛用于病原微生物耐药机制、基因序列及分型、分子流行病学监测等。由于基因芯片制备成本高，检测仪器昂贵，目前还未广泛用于临床病原微生物的检测。但可以预测,基因芯片技术未来将具有广阔的发展和应用前景。
蛋白质指纹图谱技术是随着蛋白质组学兴起的一种新技术。不同属种的细菌具有不同的蛋白指纹图谱，同一种细菌具有相似的蛋白指纹图谱，根据细菌蛋白指纹图谱可对细菌进行快速鉴定。目前常用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）来检测细菌、真菌等微生物，其原理为激光照射样品与基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸)形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程是将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，带电荷的生物分子在电场作用下加速飞过飞行管道到达检测器，飞行时间与待测分子的质荷比与成正，通过专用软件分析比较，达到鉴定病原菌的目的。据报道，MALDI-TOF MS对临床微生物属、种鉴定正确率在85%以上，但对大肠埃希菌和志贺菌，以及缓症链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌等α-溶血性链球菌较难区分。尽管如此，MALDI-TOF MS将逐步成为微生物鉴定的主流方法，对推动和提速微生物实验室的自动化具划时代的意义。另外，采用质谱技术研究耐药机制的报道也逐步增多。因而，MALDI-TOF MS可为感染疾病诊疗和抗生素合理使用提供更加有力的支持。
目前，我科已准备采购质谱仪，希望能快速鉴定临床微生物，为临床抗感染治疗提供科学依据。

《医》：我国幽门螺杆菌（Hp）的耐药率不断攀升,抗生素耐药菌株的出现已直接影响到Hp根除率,据报道国际标准三联疗法根治率已降至67.2%,因此对所分离培养的幽门螺杆菌菌株进行药物敏感试验指导临床治疗意义重大。您的实验室在此项检测上的情况是怎样的？
1982年发现幽门螺杆菌(Hp)至今,已有26年的历史。Hp的感染与慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等疾病密切相关。Hp感染者占了全球人口的一半以上,中国是Hp感染率较高的国家，感染率约35-87%。Hp感染问题受到大众的广泛关注。目前认为“人－人”、“粪－口”是Hp感染主要的传播方式和途径，而Hp感染发病率的高低与社会经济水平、人口密集程度、公共卫生条件以及水源供应有较密切的关系。而且，Hp感染在家庭内有明显的聚集现象,父母感染了Hp，其子女的感染机会比其它家庭高得多。
目前，选择杀灭Hp的最佳治疗方案及避免或克服Hp耐药性是临床关注的热点和难题。据统计，我国Hp对不同抗生素的耐药率分别为:甲硝唑50-100%(平均75.6%),克拉霉素0-40%(平均27.6%),阿莫西林0-2.7%。其中,Hp对甲硝唑的耐药是全球性的。Hp的耐药性是导至Hp根除治疗失败的主要原因，即为何一些慢性胃炎和胃十二指肠球部溃疡病人久治不愈。
Hp检测包括侵入性和非侵入性两类。侵入性方法依赖胃镜活检，包括快速尿素酶试验、胃粘膜直接涂片染色镜检、胃粘膜组织切片染色镜检、细菌培养、基因检测等。非侵入性检测方法不依赖胃镜检查，包括13C或14C尿素呼气试验、粪便Hp抗原及血清Hp抗体检测。其中胃粘膜组织的Hp培养、药敏试验是诊断Hp感染、提高治疗效果最准确方法。
我院目前开展快速尿素酶试验、血清Hp抗体、13C或14C尿素呼气试验，有关Hp分离培养及药敏试验等工作正在准备中。

《医》：关于JAK/STAT信号通路在EV71感染的诊断价值，您是如何看待的？
肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)的常见病原体。EV71引起的HFMD患者常伴有神经系统症状，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、小儿麻痹症样瘫痪以及肺源性水肿等严重并发症，重症病例常导至死亡。迄今为止，针对EV71感染的防治主要有疫苗、抗病毒化学合成药物及外源性细胞因子等，但临床应用效果仍不理想。
Janus激酶/信号转导和转录激活子（JAK / STAT）信号通路使得细胞外的化学信号跨越细胞膜并将信息传送到细胞核内DNA上的基因启动子上，最终引起细胞中DNA转录与活性水平发生改变。细胞因子、生长因子、干扰素等参与JAK/STAT信号通路的活化，与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程有关。JAK/STAT系统由受体、JAK激酶与STAT三个主要部分组成，是除了第二信使系统外最重要的信号途径。一般而言，病毒感染刺激宿主细胞产生细胞因子和干扰素，这些配体结合到受体而激活了JAKs，随着激酶活性增加，JAK可以磷酸化受体上的一些酪氨酸残基并产生出可以与含结合SH2结构域的STAT类蛋白相互作用位点。当STAT被招募到受体，其酪氨酸被JAK磷酸化，接着这些磷酸化的酪氨酸被当作其它STAT类SH2结构域的结合位点，介导其可形成异源或同源二聚体，然后入核并激活干扰素刺激反应元件（ISRE），导至多种干扰素刺激基因(ISGs)活化，从而影响细胞生长、存活、分化、运动性及免疫应答。
然而，一些病毒在长期的进化过程中已能阻断宿主细胞的JAK/STAT信号通路中关键分子（如JAK1、STAT1和STAT2等）而逃避宿主固有免疫应答。如日本脑炎病毒NS5通过激活蛋白酪氨酸磷酸酶而阻断干扰素刺激的JAK/STAT信号。人偏肺病毒感染A549细胞和正常人支气管上皮细胞后，可通过抑制IL-6诱导的JAK/STAT中JAK2磷酸化而阻碍STAT3核转录。EV71编码的2A蛋白酶通过减少RD细胞中干扰素受体而拮抗I型干扰素信号。
EV71感染不仅刺激树突状细胞（DCs）中 JAK1、JAK2、STAT1和STAT2的磷酸化，而且促进了IL-1α、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的分泌，提示JAK/STAT信号通路在EV71感染的DCs中发挥重要调控作用。这些关键分子可望成为新的抗EV71药物的靶点。因此，深入研究EV71感染及其发病机制，对提高临床疗效、降低死亡率，具有重要的科学意义。

《医》：CLSI2015年药敏标准的最大改变之处在于引入carbanp试验和流行病学cutoff值的概念。您的实验室此方面是如何做的？
我国微生物实验室药敏试验均遵循美国临床与实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的药敏试验标准。CLSI 2015年药敏标准（M100-S25）的最大改变之处在于引入Carba NP试验和流行病学cut off值的概念。
（1）Carba NP确证试验是一种肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动菌属细菌中碳青霉烯酶的表型检测方法。该试验采用比色法，目前主要用于流行病学研究或感染控制，尚不推荐作为临床常规使用。研究表明，Carba NP试验在检测KPC、NDM、VIM、IMP、SPM和SME型碳青霉烯酶方面具有较好的敏感性（>90%）和特异性（>90%）。但对OXA-48型碳青霉烯酶敏感性低（11%）。
1）Carba NP试验试剂配制
①10 mM七水硫酸锌溶液：1.4g ZnSO4×7 H2O，加入500ml试剂级纯水，混合，室温保存。
②0.5%酚红溶液：1.25g酚红粉末，加入250ml纯水，混合，室温保存。使用前混匀。
③0.1 N氢氧化钠溶液：将20ml 1N NaOH加入180ml纯水中，室温保存。
④Carba NP试剂A溶液：取25-50ml烧杯，将2ml 0.5%酚红溶液加入到16.6ml纯水中，再加到180ml 10mM硫酸锌溶液中。用0.1N NaOH溶液（或10% HCl）调整pH值为7.8±0.1，4-8℃小瓶保存，避光。
⑤Carba NP试剂B溶液（A液+6mg/ml亚胺培南）：每株待测菌100ml/管。如检测两株待测菌，还须包括阳性和阴性对照、未经处理的试剂质控，共需500ml B液。称量所需的亚胺培南。建议至少称量10mg粉末，将实际称重量除以6，以计算所需加入的A液量。

   2）操作步骤
   选取血平板上过夜的菌落，不能选取含有抗生素培养基或选择培养基上的菌落。试验分待测菌、质控菌、试剂质控有三个部分。试剂质控部分不需要加入细菌，不需要孵育。
   1）分别在管“a”和管“b”中加入100μl 细菌蛋白提取液，再用1μl接种环挑取待测菌混悬5s。
   2）管“a”中加入Carba NP试剂A溶液，管“b”中加入 Carba NP试剂B溶液，35±2℃ 孵育2h，观察结果。
   3）Carba NP试验结果解读

  图1 Carba NP试验结果解释。
注：管“a”（A液未加亚胺培南）和管“b”（B液加入亚胺培南）的颜色反应比较。①结果阴性（未检出碳青霉烯酶）：管“a”（A液）红色或橙红色，管“b”（B液）红色或橙红色。②结果阳性（检出碳青霉烯酶）：管“a”（A液）红色或橙红色，管“b”（B液）浅橙色、深黄色或黄色。③结果无效：管“a”（A液）红色或橙红色，管“b”（B液）橙色；或管“a”（A液）出现红色或橙红色以外的任何颜色（包括橙色、浅橙色、深黄色或黄色）
4）常见检测碳青霉烯酶的试验比较。见表2。

表2. 检测碳青霉烯酶相关试验的比较
改良Hodge试验 Carba NP试验其他(如分子检测)
细菌对1种或1种以上碳青霉烯类不敏感的肠杆菌科细菌对1种或1种以上碳青霉烯类不敏感的肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌属对1种或1种以上碳青霉烯类不敏感的肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌属是否产生碳青霉烯酶；检测改良Hodge试验和Carba NP试验阳性菌株的碳青霉烯酶类型。
优势易于操作；无需特殊的试剂或培养基快速可检测是否产生碳青霉烯酶及分型
局限性 1)假阳性：产ESBL或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失的菌株；
2)假阴性：偶尔出现（产NDM金属酶菌株）；
3)仅用于肠杆菌科细菌 1)需要特殊的试剂；
2)某些菌株检测结果无效；
3)无法检测某些碳青霉烯酶（如染色体编码的OXA型碳青霉烯酶） 1)需要特殊的试剂和仪器；2)只对靶基因特异；
3)对未检测的特异性碳青霉烯酶基因可出现假阴性
(2)流行病学cutoff值（ECVs）
ECVs（epidemiological cutoff values）是根据体外药敏表型（MIC值）来区分有无获得性和/或突变耐药细菌，该MIC值即为ECVs。“野生型”指菌株MIC值≤ECV，无获得性和（或）突变耐药；“非野生型”指MIC高于ECV，则菌株有获得性和（或）突变耐药可能。临床折点是根据抗菌药物MIC分布、相关细菌、PK/PD和临床疗效等建立的。而ECVs是通过汇总不同来源细菌的MIC值来估计野生型菌株MIC值分布的上限，即获得ECVs，主要用于判断非野生型菌株的出现和发展。
为了得到可靠的ECVs，必须具备以下条件：只能确定单一菌种的ECVs；MIC值必须是采用参考方法确定；数据应不少于100株菌，且必须来源于至少3个独立的实验室；MIC值分布应尽可能在稀释范围内。
CLISA M100-S25新增加了万古霉素对痤疮丙酸杆菌的ECV。万古霉素可用于治疗痤疮丙酸杆菌感染，但目前尚无足够的数据建立临床相关折点。根据ECV,当万古霉素MIC≤2μg/ml时，判为野生型菌株；当万古霉素MIC≥4μg/ml时，判为非野生型菌株。经验表明,由非野生型痤疮丙酸杆菌引起的感染，万古霉素治疗效果差。为保证临床治疗效果，确认后的MIC值和ECV数据应与临床医生和药剂师共同讨论，且MIC结果不应报告为敏感、中介或耐药。

《医》：微生物实验室与临床间的沟通非常重要，在您的实验室是如何做的，有没有一些好的经验和同行分享？
微生物实验室发出的菌株鉴定、药敏试验结果及评价，对指导临床科学、合理使用抗生素，有效控制感染，具有重要作用及价值。相比检验科其它专业组，微生物实验室更需与临床进行良好的沟通及交流。下面列举了一些我们实验室与临床交流的方式及方法，与同行分享。
（1）临床随访交流：微生物实验室应配置检验医师，参与临床查房和疑难、危重病例的会诊，对微生物结果做出解释，并对临床诊断和治疗提出建议。掌握检验项目的临床意义及临床医师的需求，评价检验项目、合理组合，规划和开展新项目，并推动其临床应用。
（2）抱怨处理：工作人员接到临床、病人等方面的信息反馈后(书面或电话等)，应及时记录内容，并向检验医师、专业主管或科主任汇报。一般的反馈意见由实验室自行处理，及时给对方满意答复。如属重大纠纷或差错，应立即向科主任汇报，由科主任负责处理。针对问题，特别是重复发生的问题寻找原因，建立新的操作程序，防止问题的再次发生。
（3）岗前培训：积极主动配合护理部、医务处工作，对每年新入职的护理人员、医师进行岗前培训，内容包括微生物检测项目选择检验申请、标本采集、运送、存储、结果判断及分析、抗生素合理使用等，提高新职工对微生物检验的重视。
（4）征求临床意见：虚心听取临床医师、护理部及患者对微生物室工作的意见或建议，不断改进服务态度，提高检验质量，为临床提供及时、准确的检验报告。同时，通过相互沟通，也取得临床医护人员对实验室工作的支持和理解。定期更新、发放《样本采集手册》，指导临床正确采集和运送样本，进一步提高微生物标本送检质量。
   （5）定期向临床发布信息
   1）每季度向全院发布细菌及多重耐药菌监测数据，分析重点科室，如ICU、呼吸科、血液科、烧伤科等多重耐药菌分布情况，以助临床经验性应用抗菌药物。
   2）参与临床重点科室的院感目标性监测会议，与临床、护理交流近期存在的问题，商讨解决方案。
   3）对重点科室相关人员授课。协助临床正确解读微生物检验报告单，积极向临床医护人员介绍微生物检验的新方法、新技术。
（6）加快微生物实验室信息化建设。建立危急值报告制度，健全网络信息，真正实施微生物三级报告，尽快将初步鉴定、药敏试验或结果评价报告发布给临床，为临床科学合理用药提供重要依据。

《医》：微生物实验室质量控制应注意哪些问题？
   微生物实验室全程质量控制包括评估人员能力、设备性能及环境、标本质量；监督操作过程，监测试剂、培养基，验证(确认)实验方法，审核检验结果，发布实验室结果等。并通过持续监测，发现问题、解决问题，采取纠正措施、预防措施，不断提高微生物检验质量。在日常工作中，质量控制应注意以下相关问题：
（1）人员能力要求：挑选年资高、工作经验丰富的检验人员从事微生物检验，并优先配置高学历人才。对新员工培训、老员工的再培训以及员工工作能力进行评估，考核合格后授权上岗。定期组织学习及培训，掌握各种传染病职业暴露后应急预案及处理流程，熟悉感染性疾病和抗菌药物使用等理论知识。
（2）试剂质量
1）培养基：对每批次培养基、平板、培养瓶、鉴定板条等进行质量验证，包括无菌试验、生长或抑制试验、生化反应等，监测保存温度，并在有效期内使用。
2）染色液：革兰染液、Ziehl-Neelsen抗酸染液、特殊染液（芽孢、荚膜、鞭毛）、荧光抗体染液等按规定每周/每次质控。
3）抗血清（鉴定用）：每批试剂/启用日并每月。
4）凝固酶、触酶、氧化酶、β-内酰胺酶：每批试剂并每次使用。
（3）仪器设备：建立仪器设备档案，制定和执行标准操作规程，监测并记录仪器设备的运行情况，按照要求对相应仪器设备进行维护、保养和维修，新设备或经维修的设备应进行功能检查并记录，对天平、pH计、离心机、加样枪、温度计等需进行校准，冷藏和培养等设备应进行温度监控并记录。
（4）样本质量监控：样本质量是影响微生物实验室结果的关键环节，实验室须向临床提供标本采集和运送手册，内容包括采集部位、采集数量和体积、采集时机、保存条件、保存时间、标本运输等，标本验收时须核查送检时间、标本质量。不合格标本退检时需与临床沟通，并详细记录。
（5）检测方法确认：实验室开展新项目前须论证新增项目的临床意义、所需人力、设备及空间资源情况、三证是否齐全，并征求相关临床科室专家意见。经方法学评价后，选择开展准确性和重复性好、检测结果与临床相关性好试剂。更换新的检测方法时，应证明其准确度和精密度良好，并在工作人员具备相应的操作能力和具备研判和报告结果的能力后进行。经方法学确认的试验方法，应记录其质控资料、人员能力、PT结果、仪器校准、临床相关性等资料，新项目实施后还须持续跟踪调查，评估对临床诊断价值。
（6）检验过程的质量控制：
1）室内质控：核收标本时，观察标本性状；痰液直接涂片，拒收不合格标本。选择接种具有病理意义的标本，根据检验目的使用恰当的培养基分离细菌；选择具有临床相关性的分离株进行鉴定，并根据分离菌种的生物学特性和感染部位选择恰当的药物进行药敏试验。对实验室使用的试剂、培养基、染液以及仪器设备等均应进行监测、评估和记录，定性试验应用阴、阳性对照进行质控；定量试验采用两个不同水平的质控品，检测程序应与患者标本检测相同，质控频度应根据不同的项目而定。
   2）室间质量评价：积极参加国际、部省级室内质评价活动。接收质控品时应有检查、登记并正确保存，未接到质控品时或质控品有破损或错误时应及时与组织者联系。质评标本应用常规方法检测，反馈信息应进行评估、总结与改进。
（7）报告质量评估：定期评估报告的准确性和时效性。根据微生物室实际情况，延长排班时间或增设夜班，及时处理送检标本和培养阳性标本，缩短报告时间；检验报告用语规范，正确描述或报告涂片检查所见，针对检验结果标注提示性评论或建议。及时修正错误报告，即刻通知临床医师。对重复发生的问题或错误须认真寻找原因，建立新的操作程序，防止问题的再次发生。
（8）报告质量改进：结果报告至少应包括实验室名称、参考范围、不合格标本拒收的原因、检验结果、提示性建议等。不断引进新技术、新方法，缩短TAT时间。完善微生物信息化系统建设，实行分级报告，重要病原菌即刻报告。工作人员还须提高自身理论水平和业务技能，加强与临床的沟通交流，为临床科学、合理使用抗生素提供重要依据。

《医》：您的工作中有没有遇到一些微生物检测工作的问题，可以在此提出方便看到的同行能够交流，提供建议？
（1）临床不合格标本的处理。特别是标本量最大的痰培养。
（2）痰标本（3+--4+）的细菌该如何区分感染与定植问题。
（3）痰涂片染色结果与培养结果矛盾的解释。

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