DNA分子计数技术对无创产前检查之影响 小孩子到了一定年纪,都会对自己从哪里来产生兴趣,这个问题往往让父母支支吾吾、闪烁其词。廖信忠在《我们台湾这些年》提供了一个答案,印象深刻。他妈妈当年这么回答,大意是:爸爸给妈妈打了一针就有了你,颇具禅机。 王小平在《我的兄弟王小波》“写在前面”的部分对遗传因子的描述很得要领:“一个人本质上相当于一个万花筒。在出生之前,这个万花筒被造物之手簸动,衍生出难以计数的花纹。但一旦出生,此图案就此凝结”。遗传病本质上就是凝结成的图案有了瑕疵,这个过程从进化的角度看再自然不过,但对个人和家庭着实不幸。 听同事说她一个朋友孩子出生的时候,作为医生的父亲关心的不是宝宝是男是女,而是先检查娃娃十个手指,十个脚趾是否齐全。那些迎接宝宝降临人间的父母们,心态估计就像《阿甘正传》里面那句经典台词:生命就像一盒巧克力糖,你永远不知道盒里乾坤。 好在母体内胎儿游离DNA的发现,为无创产前检测提供了更多的可能。DNA分子计数技术的出现、成熟与广泛使用,使得对胎儿游离DNA的检测达到前所未有的精度,从而实现对不同遗传疾病的检测,无论是单基因遗传病还是染色体的非整倍性疾病。本期推荐由香港中文大学Dennis Lo实验室的Allen Chan教授撰写的综述,介绍数字PCR和NGS(深度测序对每个DNA分子进行序列读取,当然也可以看成是一种核酸层面的计数技术)这两种DNA分子计数技术在NIPT方面的应用及带来的影响。 早期发展 1997年,Dennis Lo通过普通PCR扩增的方法证明了胎儿游离DNA的存在,该发现奠定了日后通过母体血浆中胎儿游离DNA的分析进行NIPT的基础。早期对胎儿游离DNA的检测主要集中在对父源性特异序列的定性分析,如果在母体血浆中检测到这些靶标序列,那就证明胎儿经遗传获得了父本的特异性序列。该策略的一个早期应用是通过RHD基因的序列分析进行Rh阴性血怀孕妇女的监控。 目前通过对父源性血浆游离DNA的分析进行NIPT,已经扩展到常染色体显性遗传类疾病,如软骨发育不全、肌强直性营养不良和亨廷顿氏舞蹈症等。但该策略不能应用于其他遗传模式的疾病,诸如母源性导至的常染色体显性遗传类疾病、常染色体隐性遗传类疾病和染色体的非整倍性疾病。因为这些情况下,无论胎儿是否获得致病序列,在血浆内都能检测到来源于母亲本身的靶标序列。因此需要更精确的检测技术及更强大的数据处理方式。 DNA分子的“数字式”计数 数字PCR对DNA在单分子层面的绝对计数流程与工作原理见下图。在数字PCR之前,广泛采用的荧光定量PCR通过Ct值对核酸进行定量计算,这种定量方法的理论依据是在每轮PCR循环后PCR的扩增产物翻倍,因此荧光定量PCR最小能分辨2X差异的情形。数字PCR采用计数的方式进行定量,因此检测精度更高,甚至根本不需要荧光定量PCR检测中需要的标准品。(数字PCR技术的原理、发展历程、操作流程及大致应用在本公众号的第一期和第二期有详细的介绍) 不同的数字PCR设备 早期的数字PCR往往手工进行反应体系的partition,一般在几百个partition number的水平,耗时且操作繁琐。目前越来越多的商业化数字PCR平台面市,实现了该技术的高通量、自动化。不同厂商的设备及主要性能见下表。 Fluidigm最早采用微流控芯片的方式实现了商业化的数字PCR,partition number接近1000,但该方式成本较高,尤其对于常规的临床检测而言。之后面市的基于“油包水”方式的微滴式数字PCR使用成本更低,相信在NIPT领域比微流控芯片的数字PCR有更好的应用前景。原文引述如下:
大规模平行测序(Massive parallel sequencing, MPS) 对于NIPT,MPS是一种有力的工具,能在一个反应里对血浆中成百万的DNA进行测序。数字PCR实验方案的设计需要以明确的靶序列信息为前提,而MPS完全不需要,这尤其使得MPS在染色体非整倍性疾病的分析方面具有优势。但目前来看,MPS在实验成本及检测时间上不如数字PCR。原文引述如下:
胎儿DNA浓度的测定 了解胎儿DNA在母血内的浓度是NIPT的质控标准之一,对后续的数据分析至关重要。早期测定胎儿DNA浓度的方法是利用荧光定量PCR分别测定胎儿特异性序列和胎儿、母体共有序列的方式来实现。通过测定SRY基因,孕早期和孕晚期胎儿DNA的平均含量分别为3.4%和6.2%。采用数字PCR检测后发现,胎儿DNA的含量更高,在早、中、晚期的含量分别是9.7,9.0和20.4%。 单基因病的检测 对于常染色体隐性遗传类疾病和常染色体显性遗传类疾病,携带者具体突变的定性分析是不够的,一种称为Relative mutation dosage(RMD)的分析是必要的,这种分析的原理见下图,其中假定胎儿DNA的含量占母体血浆的10%。 按上图所示,如果胎儿是纯和的野生型或突变型,那么母体血浆内不同等位基因间总体的最大差值就在20%。如何对如此小的差异进行分析?Dennis Lo实验室采用了一种称为sequential probability ratio testing(SPRT)的统计学算法,具体模式及举例见下图。 下图的例子中,母亲是某种常染色体显性遗传疾病的携带者,父亲是纯和野生型。其中横坐标是母体血浆中总共被分析的分子数,纵坐标是野生型对突变型的比例。如果该比例落在颜色区域,结果则具有统计学意义。如果落在红色区域,说明胎儿的基因型为野生纯和;如果落在蓝色区域,说明胎儿的基因型为杂合。SPRT分析中,实际需要分析的分子总数目不能在实验前确认。下图的例子中显示,总共经过了4轮测试得出具有统计学意义的结果。这种分析策略可以用于诸如地中海贫血、血友病和甲基丙二酸血症等遗传病的检测。 注:如对SPRT分析想做进一步了解,请参看论文:
染色体的非整倍性分析 通过母体血浆DNA的分析来确认染色体的非整倍性状况,在技术上面临挑战。如果假定胎儿DNA占母体血浆总DNA的10%,理论上唐氏综合症胎儿导至21号染色体含量的增加只有5%。早期检测技术不可能对如此小的差异进行分析,所以早期NIPT的努力方向致力于发现胎儿与母体之间差异化的基因序列(如SNP位点、甲基化位点等),再针对这些差异序列进行分析。但这样的工作思路不够理想:1、寻找这些差异化位点耗时耗力;2、找到的差异化位点不能适用于所有人群。 不断涌现的DNA计数技术大大加速了利用通用序列对染色体的非整倍性进行分析。目前只需要对母体血浆DNA中的目标染色体(例如21号染色体)和参照染色体分别进行计数,就能得到chromosome dosages。具体分析中,被分析的分子总数目决定了结果的精度及统计学上的有效性。如果胎儿DNA的含量较低,就要求有更多的DNA分子被分析(被计数)。计算表明:如果母体血浆内胎儿DNA的含量减少50%,那么数字PCR分析的DNA分子数目需要增加400%。本综述同时对胎儿DNA的含量与总共需要被计数分子数目之间的关系进行了计算,见下图。如果胎儿DNA的含量为5%,那么在灵敏度95%和特异性99%的条件下,总共需要计数21号染色体DNA的分子数为100,000个,同时作为参照的染色体计数总数也需要在相同的水平。 通过上述计算,采用数字PCR技术进行非整倍性分析几乎是不可能的,因为在常规采血量的条件下不可能获得如此数量级的分子数。但如果对目标染色体与内参染色体上进行多个位点的同时检测(多重检测),可以在不提高采血量的情况下增加被计数分子的总数目。这不失为一种利用数字PCR技术进行非整倍性分析的思路,原文如下:
上述设计思路在RainDance公司编号为LCN 50-07052 Rev A的Application note中已经进行了初步尝试,具体实验方案见下图。对21号染色体和18号染色体分别检测20个位点,采用Roche公司的Universal Probe Library (UPL),其中18号染色体采用FAM检测,21号染色体采用TET检测。当然,实验人员也可以根据NGS的结果来选择染色体上的具体位点及检测位点的个数。 数字PCR技术之外,NGS已经成为NIPT进行染色体非整倍性分析的成熟技术,主要的工作来自Dennis Lo实验室一系列奠基性的工作,不再赘述。可参考其中最关键的文献。
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