 在过去十年，高通量测序技术（又称为二代测序技术）迅速发展，并成功应用于遗传性疾病及肿瘤的诊断。最近，另外一个分子诊断领域的红人就是－液体活检技术。如能将高通量测序技术运用在液体活检上，将为分子诊断开拓一个更为广阔的天地。液体活检包括循环肿瘤细胞和游离核酸（主要是循环肿瘤DNA）的检测。这期我们关注的是二代测序在检测循环肿瘤DNA中的应用。 顾名思义，循环肿瘤DNA是指血液循环中的DNA，来自肿瘤细胞。肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环系统，游离地存在于血液当中。虽然这些DNA是断裂的，不完整的，但它来自于肿瘤细胞，如果肿瘤细胞携带某种基因突变，这些突变也能在循环肿瘤DNA中反应出来。通过检测循环肿瘤DNA的基因突变，就可以揭秘体内肿瘤组织的突变信息，从而为肿瘤的靶向治疗和药效检测提供依据。 此前已有文章介绍过微滴数字PCR技术可以非常有效的检测到循环肿瘤DNA中的突变，常涉及的突变有EGFR的L858R突变, 19外显子缺失, BRAF的V600E突变等，对于这些位点的检测，准确性可以达到0.01%，可以说目前为止还没有其他技术可以超越这种灵敏度。但是该技术有局限性：一，在做检测前必须明确要检测的位点，不能检测未知位点；二，一个位点一个位点地检测既耗时又增加了成本。高通量测序技术正好可以弥补以上不足。 高通量测序检测循环肿瘤DNA，一般会选定十几到几十个肿瘤相关基因，技术关键在于如何富集这些相关基因。目前常用的富集方法有两种：PCR扩增法和探针捕获法。PCR扩增法是针对目的基因设计几十对甚至上百对PCR引物，利用多重PCR扩增富集。探针捕获法是针对目的基因设计探针，通过杂交的方法富集。由于从血液中得到的游离DNA大部分来自于正常的血细胞，循环肿瘤DNA只占极少的比例，更要求富集的过程要高效均一，甚至需要采用突变特异的富集方法，从而最大可能地检测到来自肿瘤的突变DNA。 由于循环肿瘤DNA的二代测序检测准确、灵敏、无创且高通量，目前已用于靶向治疗的实时监测。两个月前英国癌症研究所Bono实验室发表在《临床癌症研究》（Clinical Cancer Research）上的文章报道了循环肿瘤DNA的二代测序检测在监测靶向药物疗效中的应用。该研究来自一个针对PI3K-AKT-mTOR信号通路的靶向药物的临床实验，共39位病人参与此项研究，这39位病人均罹患癌症，在服药前已有不同程度的癌细胞转移迹象。首先，该研究证明外周血中检测到的突变均在手术活检样品中出现，说明循环肿瘤DNA可以反应肿瘤组织 分子水平变化。接下来，在服用靶向药物过程中，每隔一段时间收集外周血进行循环肿瘤DNA的测序，用以监控上述信号通路中的热点突变的变化，从而为判断药物的疗效提供依据，结果显示，循环肿瘤DNA突变的变化趋势与传统CT检测到的肿瘤大小变化基本一致，实现了肿瘤分子水平监控。靶向药物针对基因突变而设计，因此监测循环肿瘤DNA中的突变变化可以更灵敏准确地判断靶向药物的疗效。 高通量测序检测循环肿瘤DNA技术, 既然只需要少量的外周血，就可以检测出肿瘤DNA中的突变，这个技术是否可以用在肿瘤早期筛查呢？由于肿瘤早期，外周血中含有的肿瘤DNA极其微量，要做到肿瘤早期检测，对灵敏度要求非常非常高。目前已有报道，通过优化实验方案，提高检测灵敏度。肿瘤循环DNA的二代测序是否可以成功地用于癌症筛查，我们拭目以待。 |
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