【cfDNA专题】cell-free DNA在非肿瘤疾病中的临床价值

近期我们在开展一个优化cfDNA quantification 和 qualification 方法学的小课题。尽管这个课题的初衷，是为了更精准地开展ctDNA研究提供一个技术基础，但我认为cfDNA，包括我们这个小课题的价值，并不仅限于此。现将课题立项阶段，我对cfDNA在非肿瘤疾病中的应用前景的思考分享给大家。

再谈Cell-free DNA的历史

Cell-free DNA最早的发现就不是在肿瘤患者的血样中，他是1947年由法国科学家Mendel和Metais在健康人的血清和血浆中通过高氯酸沉淀的方法发现了存在DNA。但在那个时候，人类都还没有意识到DNA是遗传物质（1953年DNA双螺旋的发现才给足DNA作为遗传物质的名分），因此并没有充分地引起大家重视。

人们第一次发现肿瘤和血清中的DNA含量存在一定关系是在1977年，但当时并无法知道这些DNA是否来自于肿瘤细胞还是正常组织。直到1989年，人们才通过DNA链的热力学稳定性比较，第一次确定在肿瘤患者血浆中发现的DNA有一部分是来自于肿瘤细胞的。与肿瘤不同，cfDNA最早引发医学界普遍重视是在20世纪60年代，当时人们在系统性红斑狼疮的患者体内发现很高水平的cfDNA。

因此，从Cell-free DNA的科学发现史上看，我们就有理由相信它不是肿瘤生物学的专宠。

Cell-free DNA的来源

Cell-free DNA的来源主要有两种。一种就是细胞凋亡过程中产生的“DNA ladder”式的片段化核酸，它们的大小基本上在150-200bp左右。还有一种就是细胞被裂解——这种裂解既可以来源于物理性刺激引发的坏死，也可以是免疫细胞杀伤作用。这种过程产生的核酸很大，会接近基因组DNA大小。当然，不管是哪一种方式产生的cfDNA，它们都会进一步在外周血中被快速清除——这个时间可能是数十分钟至数小时不等，但机制尚不清楚。还有一些极痕量的cfDNA，会存在于不同类型囊泡结构中，如exosome。它们会相对来说稳定一些，但是由于量太少，在此不着重讲述。

从cfDNA的来源来看，我们能得到两个信息：

cfDNA实际上是一种机体细胞损伤的产物，不管它是来自细胞凋亡，还是细胞裂解。

基于cfDNA较短的半衰期，我们可以认为检测到的cfDNA含量，是实时地反映了DNA的释放和清除两方面因素平衡后的情况。目前，尚无研究系统地阐明cfDNA在血液中被清除的主要机制。因此，大家通常默认DNA的释放机制，是决定cfDNA含量的核心因素——换句话说，我们看到的cfDNA多/少了，自然地推论是产生这些cfDNA的细胞群体增多/减少了。

理解这两点，对于理解cfDNA的潜在临床价值很有帮助。

Cell-free DNA与机体细胞损伤相关疾病

如上所述，cfDNA来源于机体细胞损伤，因此我们可以做一个思维实验：对于健康的人，他血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢，因此应该维持在一个较低的水平。然而，当有很严重的系统性器官损伤时，大量死亡的细胞（不管是凋亡或是坏死）会产生大量的cfDNA。因此，我们就有可能通过cfDNA的含量变化，来对这类型疾病进行一个评估。

事实上，这样的假设是成立的。目前已经有很多文献，证实在包括系统性红斑狼疮在内的风湿性关节炎，肾小球肾炎，胰腺炎，炎症性肠病、肝炎等炎症疾病患者血浆中，都能够显著性地检测到cfDNA相比健康人群含量大大增加。

因此，似乎cfDNA的临床应用方向，更多地是和显著性的机体细胞损伤这一病理性情境相关联。但是，这个结论可能还要排除掉一些特殊情况。我能想到的一种情形，就是短时程，急性的器官性损伤，例如药物的毒性。因为对于代谢较快的药物来说，它发挥细胞毒性时间窗口较窄，相应地引发的细胞损伤造成的cfDNA检测窗口也会较窄。因此，我们很可能检测不到预期的cfDNA的含量和细胞毒性成正比。

我的这个感觉，其实来源于ctDNA含量在肿瘤化疗疗效监测中的数据。大部分的数据显示，肿瘤化疗效果好，ctDNA的含量是降低的，而并非上述“机体细胞损伤”假说中的相应升高。我的解释是，ctDNA监测的时间通常都是在接受化疗后1周，甚至2周，而这个阶段，药物已经代谢殆尽，故不是化疗药物最主要的杀伤窗口，而更多是一个反映肿瘤负荷的窗口——尽管这个时候肯定也会存在一些肿瘤细胞源于治疗的死亡，但相比之下肿瘤负荷的降低对ctDNA的含量影响更为显著。

因此，持续性的机体细胞损伤（这种持续时间，应该显著性地长于cfDNA的清除周期），对于cfDNA在临床上的应用，可能也是必要参考的。那么cfDNA在临床应用方面，还有哪些潜在的问题亟需解决呢？

Cell-free DNA在临床应用中亟需突破的局限性

cfDNA的可衡量参数太少

说白话，就是我们分析cfDNA能够测什么——暂时主流只能测含量。一种检测对象，可衡量的参数越多，对不同临床应用的区分度就会越好，也就是我们常说的特异性会更好。ctDNA为什么比cfDNA在作为biomarker方面更有优势，因为它能够测定碱基序列特征，这就大大拓展了ctDNA衡量尺度的多元化。因此，在我们的项目中，也刻意设置了一些关于cfDNA新的参数，期待看到这些参数在临床应用中体现出特别的含义。

cfDNA的人群基线波动性太大

由于cfDNA与机体体内细胞新陈代谢速率和细胞损伤（如慢性炎症等）相关，因此，对于我们每个不同程度亚健康状态的个体来说，可以想象个体间的差异将会是非常显著的。在一个基线都不稳定的水平下，怎么设定一个相对代表性的cut-off值（即使cfDNA的测量方法是完美的clinical test grade），这本身就是一个难题。我的一个预测，cfDNA的应用可能会参照炎症因子测定，用监测零点的基线水平做均一化（当然合理的基线水平是肯定要确定了，超过了这一变化范围，cfDNA检测的敏感度肯定是大受影响），随后关注cfDNA的fold change，而并不是简单的绝对数值。

cfDNA的特异性很差

这种特异性较差，与前两点局限性是同根同祖，密不可分的。换句白话说，我不可能通过cfDNA的含量数值，或者变化趋势判断究竟是哪里的机体细胞发生损伤。

或者说个ctDNA中类似的观点，我不可能（至少很难很难）在最高分辨率的影像学没有发现原发灶肿瘤之前，通过TP53，KRAS，BRCA1等等的突变判断你哪个器官得了肿瘤。

因此，cfDNA的应用，必须要基于特定的临床应用情境，也就是圈定在“高危人群”中使用，例如接受异体器官移植患者，已经明确诊断的系统性红斑狼疮。只有在这种比较明确“机体细胞损伤”发生来源的“高危人群”中，cfDNA的含量变化才有可能跟更明确的病情进展相联系，才有可能辅助临床干预决策。

cfDNA检测能否比现有手段更好

在没有分子生物学技术高速发展的时候，临床医学已经发展出很多检测手段用来评估cfDNA打算应用的临床舞台。例如肝损伤有一整套肝功能指标，肾损伤有一整套肾功能指标，自身免疫性疾病有一整套评价标准，它们现在看起来用得还不错。即使针对cfDNA本身，现有的评估体系中也有基于anti-dsDNA，anti-ssDNA抗体的ELISA与我们熟悉的核酸检测技术（如PCR，测序等）竞争。

那么cfDNA能够从哪些方面超越现有水平呢？可以努力的方向有：检测流程更快速，成本更低（尽可能实现血浆的直接测试，摆脱cfDNA抽提）；定量更客观准确，比现有指标更精确地反映疾病进展；检测更灵敏，比现有指标创造出更大的干预窗口。