新一代测序在临床诊断中的应用案例

几个星期前，美国儿童慈善医院（Children’s Mercy Hospital）新生儿重症监护室中的一名婴儿引起了Stephen Kingsmore的注意。

Kingsmore是儿科医学中心的主任，在过去几年中，他的实验室利用新一代DNA测序技术，开发出儿科疾病的快速诊断方法。利用Illumina HiSeq 2500的快速运行模式以及一些巧妙的算法，他的研究小组在2012年首次实现了50小时快速诊断新生儿遗传病。

现在，他被要求将这种方法应用在一名孩子上，这名孩子一定要上呼吸机，因为每当他睡着时，就会停止呼吸。这种疾病被称为中枢性低通气综合征（central hypoventilation syndrome），也被称为昂丁的诅咒（Ondine’s curse）（注：昂丁是歌剧《昂丁》中的人物）。据Kingsmore介绍，它关系到多个基因。但究竟是哪个基因呢？

为了找到答案，这个病例被交给了Kingsmore。这名孩子在周五下午登记，但样本在下周一才处理。到了周三，测序仪已经完成了运行；此后，自动化的软件工具接手，鉴定遗传变异并排序。周四早上，当Kingsmore开始工作时，数据就一切就绪了。“在几分钟之内，我就有了诊断，”他说。

软件标记了某个基因中的一个突变，这个基因最初被认为不大可能引起疾病。“就引起症状的可能性而言，它被排在第99位，”Kingsmore指出，而突变的鉴定能指导孩子的治疗，或至少能帮助抉择。通常，结束生命或手术治疗的重大决定都要等到医生诊断之后。

利用新一代测序（NGS）来做出诊断，在如今的诊疗机构中越来越普遍。由Illumina、赛默飞世尔和Pacific Biosciences的测序仪所推动，临床实验室正在生产大量的DNA序列数据。因此，研究人员和临床遗传学家发现将医学谜题转化成临床行动比以往更容易。

基因集合、外显子组和基因组

一般来说，遗传实验室运行三种类型的检测：靶向基因集合、外显子组和全基因组。集合（Panel）通常包含几个到几百个基因，是最便宜的，也是最容易解释的，但是只有当关键突变位于检测基因中时，它才能提供信息。人类外显子组测序关注蛋白编码序列，这使它们很容易解释，但也存在着限制，因为许多突变都落在覆盖区域以外。全基因组测序读取每个碱基，带来了最完整的数据，以及最具挑战性的分析，更不必说最高的价格。

“测序得越少，读取得越深，这是基本规则，”Broad研究院临床研究测序平台的开发主任Niall Lennon如是说。“通常情况下，你会发现癌症集合的测序深度是500或1000倍。与外显子组相比，集合要容易得多。”

据赛默飞世尔的副总裁Mike Nolan介绍，赛默飞在美国提供两种肿瘤集合，仅供研究使用。这些检测捕获52或143个基因，只需要10 ng起始DNA，与珍贵的活检样本兼容。Nolan表示，集合上的特定基因是与制药公司合作选择的，可帮助作出治疗决定。儿童慈善医院的TaGSCAN集合是检测与儿童疾病相关的514个基因，包括“神经发育、代谢、智力障碍和免疫缺陷疾病”的基因。

威斯康星医学院遗传检测实验室的临床主任David Dimmock谈到，在00年代末，检测就开始向基因集合进化。不过，研究人员最近逐渐意识到，可能导至某种疾病的基因组合要比之前意识到的更加广泛。因此，外显子组测序越来越受欢迎，他说。“如果我们一下子测序了一切，在关联回表型时可能会有惊喜，这比每次测一个基因要好得多。”

据Lennon介绍，Broad研究院大约有40-50台Illumina的测序仪，包括HiSeq X Ten、HiSeq 4000和十几台HiSeq 2500，后者已经过临床工作的验证。不过他们实验室的绝大多数工作是基础研究。他说：“我们每30分钟产生一个30倍的人类全基因组。”2015年6月，这个机构产生了近260 Tb的数据，每天86000亿个碱基。 不过，每周的临床产出只有30-40个外显子组，而科研方面每周有数千个。

Lennon的实验室提供两种风味的外显子组测序：生殖细胞外显子组测序（深度100倍）和癌症体细胞外显子组测序（深度150倍）。从收到样本到出报告，周转时间为21天。“这些项目希望做出诊断，也想查看一些不那么显而易见的基因。我看过一些情况，人们一开始用集合，如果什么都看不到，他们就会转到外显子组，”Lennon谈道。

不过，Broad不解释外显子组。“我们提供原始数据、变异以及某些情况下的注释。但到此为止，”Lennon说。解释数据是研究人员的工作。相比之下，威斯康星医学院和儿童慈善医院都提供解释，作为他们服务的一部分。

在样本测序完之后，测序与参考基因组比对，以检出变异。软件工具根据变异可能影响蛋白的程度、它们之前是否与疾病相关联、等位基因频率等信息对它们进行排序，产生一份候选名单。这个时候，可能需要后续的研究。例如，威斯康星在报告之前通过Sanger测序确认可能的变异。“这其实是最漫长的部分。”

在2014年发表于《科学-转化医学》上的研究中，Kingsmore的实验室展示了NGS在临床上的潜力。这个实验室对100个家庭中119名患有神经发育疾病的儿童进行检测，采用的是一家三口的全基因组或全外显子组测序。45%的家庭获得了分子诊断，包括11个（73%）全基因组测序的家庭和34个（40%）的全外显子组测序的家庭。平均而言，测序之前每个家庭的诊断费用达到19,100美元，这意味着测序的性价比很高。

临床工具箱

理论上说，任何测序仪都能应用于临床遗传学。不过有一些在设计的时候就考虑了应用，如Illumina的MiSeqDx和赛默飞的Ion Torrent PGM Dx。PacBio还没有一款临床的测序仪，不过它正与罗氏合作，将长读取技术带到诊断领域。PacBio的首席科学家Jonas Korlach表示，长读取技术能在临床应用中发挥一定的优势，包括检测转录异构体和突变分相，以及大规模的结构变异。

临床基因组学的现有工具还有靶向选择系统，用来富集基因集合或外显子组，如安捷伦的SureSelect和罗氏NimbleGen的SeqCap EZ试剂。安捷伦最近还推出了OneSeq Target Enrichment试剂盒，适用于拷贝数变异的鉴定，以及一系列癌症相关基因集合，称为ClearSeq。

这些工具让临床测序比以往更加轻松。然而，此技术在某种意义上来说仍是“深奥的诊断，”Lennon说。这是因为缺乏效果的确凿数据。很少有研究像Kingsmore那样已经运行，基本都是回顾性分析或前瞻性的案例研究。Kingsmore认为，现在缺少的是关于成本效益和临床效用的前瞻性、随机研究，证明诊断率的提高能转化成临床获益。“支付机构还不太相信。”

同时，技术也在不断发展。Kingsmore表示，他的团队已经将快速全基因组测序的时间从50小时缩短到26小时，这要归功于新的算法和测序仪的改进。“现在的检测比2012年的要好得多，也灵敏得多。”对于患者、父母和医生而言，做决定也要容易得多。