循环肿瘤细胞（CTC）各种分离及鉴别方法的比较与应用

国内外有关循环肿瘤细胞 (CTC) 的研究与临床应用也是方兴未艾。由于目前有关CTC检测的各种技术手段较多，为了便于大家对此能有一个比较全面的了解，下文将目前国内外检测CTC的主要技术手段向大家做一个介绍。

CTC 是从实体肿瘤脱落入血的肿瘤细胞，它与肿瘤的转移、复发等有着极为密切的关系。有些 CTC 入血后随即凋亡，有些则只是在外周血中不断循环，而另外一些 CTC  则随血液至远端器官，形成新的转移灶。这些能够形成转移灶CTC 也被称为循环肿瘤干细胞。可见血中的CTC无论是生物学特性还是临床意义都差异极大。目前， CTC 检测在国内外已被广泛用于快速评估肿瘤的治疗疗效（包括手术及药物疗效）、预后判断，以及肿瘤耐药与复发的即时性监测等。

CTC检测主要由两个技术环节构成：分离与鉴别，也就是人们常说的“抓得着”与“看得见”。分离与鉴别方法的有效性决定着CTC检测的灵敏度与特异性。让我们首先看看人们是如何解决“抓得着”CTC的问题的。目前，国内外各种分离CTC的技术手段基本可归为3大类：过滤法，捕获法及富集法。

过滤法：代表技术为iSET。该方法使用孔径为8 微米的细胞筛过滤去除4-5微米的白细胞，从而达到分离较大的 CTC 的目的。本方法的最大优点在于便捷。然而随着近年来人们对CTC了解的不断加深，发现很多CTC实际上与白细胞一样大，有些甚至只有白细胞的一半或更小。目前有证据显示，这些小或超小CTC的数目比例在有些瘤种中可高达1/3。人们对于这些小的CTC显然不能视而不见。实际上有关过滤法灵敏性较低的客观评价国外已有多篇报道，而这些小CTC的特殊重要临床意义也已经引起了人们的密切关注 (Alunni-Fabbroni  and Sandri, 2010, Methods 50:289；Coumans, etal., 2010, Ann. Oncol. 21:1851）。

捕获法：主要代表方法为CellSearch及微流体(microfludics)。该方法的原理是将抗 CTC 表面特定蛋白标示物 (EpCAM) 抗体与磁珠或微流体进行偶联，利用这些固相载体上的抗体直接从血中捕获 CTC ，也就是人们常说的钓鱼法。该方法的优点是简便，但是近来人们发现，间质化肿瘤细胞 (Gorges, etal.,  2012, BMC 12:178) ，以及许多循环肿瘤干细胞 (Zhang, etal., 2013, Sci. Transl. Med. 5:180)，尤其是多种不同组织来源的肿瘤细胞上并不表达此特定蛋白EpCAM。最近的研究显示，在检测的134种不同肿瘤标本中，高达30%  肿瘤的EpCAM为阴性(Went, etal, 2004, Hum. Pathol.  35:122)。这种依赖肿瘤细胞自身生物学特性的方法极大地限制了应用该方法检测不同肿瘤的CTC，而且分离的 CTC 被免疫磁珠所包裹，且又被抗 EpCAM 抗体活化(Munz, etal., 2009, Cancer Res. 69:5627; Veillete, et al., 1988. Cell 55:301) ，故不适于多种后续研究。

富集法：原理是有效去除血液中的红细胞、白细胞及血浆等组份，从而达到富集非血源性CTC的目的。该方法不依赖于肿瘤细胞表面标示物 (如EpCAM）的表达，且不受CTC大小的影响，因而可以有效富集各种不同肿瘤来源且大小不同的CTC 及癌栓（circulating tumor microemboli, CTM)。富集后的CTC没有被抗体触及，维持了较好的自然状态，可适于后续一系列分析。富集法又可分为阴性富集（negative enrichment）及差减富集（subtraction enrichment, SE)。两者最大的区别在于不同于阴性富集的低渗裂解红细胞，SE选择了非低渗溶破法去除红细胞，因而避开了对CTC的低渗损伤，从而使得到的CTC适于后续的原代肿瘤细胞培养、单细胞分析等。自从赛特生物与北京协和医院在2009年共同报道了早期SE方法可有效富集各种肺癌CTC细胞，并发现86%的肺癌复发病人其CTC为阳性后（Wu etal.2009，J. Thorac.Oncool. 4:30), 优化后的SE方法已被广泛应用于多种肿瘤CTC的研究与临床应用 (Li etal, 2014, Oncotarget 5:6594；Chen etal, 2013, CCA 219:57)。

大家对如何“抓得着”CTC的各种方法已经有了比较全面的了解，我们再看看人们是怎样解决“看得见”CTC的问题的。CTC的鉴别方法主要分为多重PCR，免疫荧光染色及荧光原位杂交（FISH）等。

多重PCR (multiplexPCR) 与RNA探针检测：多年前人们已从技术上解决了利用多重PCR手段对微量稀有细胞进行检测的技术难题，可在2 个肿瘤细胞上进行多基因检测。但时至今日，无特异性肿瘤标示物或基因一直还是困扰人们的难题，基于特异性较差等原因，此方法已不再是人们关注的重点。

近年来，美国Affymetrix公司发明了使用RNA探针检测CTC的技术，可帮助人们在mRNA水平对CTC进行检测与研究。但其实际意义还有待于较大样本的临床验证。

抗体染色：实体肿瘤细胞一般均为上皮来源，细胞内会表达角蛋(cytokeratin, CK) 或其他肿瘤标示物 (如HER2)。借助免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC 中的瘤标进行识别，从而达到检测CTC的目的。这也是目前检测CTC的最常见方法。然而近年来大量的临床实验数据显示，在CTC形成过程的间质化(EMT)阶段，与EpCAM相同，大量的CK也会降解(Willipinski-Stapelfeldt etal, 2005, Clin. Cancer Res. 11:8006)，从而在CTC检测过程中出现因“看不见”而造成的假阴性。

免疫荧光染色-FISH检测 (iFISH)：染色体荧光原位杂交(FISH) 技术检测染色体数目异常的肿瘤细胞早已被人们广泛接受。但有别于常规的FISH方法，iFISH的技术原理是将免疫荧光染色与FISH进行了有效整合，在区分血源性与非血源性细胞的基础上，对CTC细胞同时进行染色体异倍体检测与任一瘤标表达的检测。相对于单一使用免疫荧光染色或FISH方法，iFISH可将染色体或瘤标异常的CTC有效检测出来，从而极大地提高了检测的灵敏性与特异性。此外，根据同一CTC上的瘤标表达与染色体数目，可将CTC进行亚类分型，每一不同亚类的CTC细胞在肿瘤的耐药、药敏、转移与复发等方面都有着不同的临床意义。赛特生物与北京肿瘤医院共同发表的最新临床实验结果提示，胃癌病人中的8号染色体3倍体CTC具有内源性耐药的特性，而4倍体或5倍体的CTC则可能具有继发性耐药的特性 (Li etal, 2014, Oncotarget 5:6594)。该发现为医生今后制定更为合理的肿瘤个体化治疗方案提供了更可靠的依据。

随着人们对CTC了解的不断加深，各种新的CTC检测手段也会不断出现。其中由美国Affymetrix 与Cytelligen 公司正在联合开发的差减富集 (SE)-iFISH-RNA FISH整合技术平台将令人们首次在单一CTC细胞上进行DNA，RNA及蛋白表达三位一体的研究。