NGS结合数字PCR准确定量拷贝数变异

哈佛医学院和Bio-Rad公司的研究人员使用二代测序（NGS）和Bio-Rad的微滴式数字PCR（ddPCR™），解决了准确定量多等位基因拷贝数变异（mCNV）的技术难题。这一成果发表在最近的Nature Genetics杂志上。

“长期以来人们一直难以对人类的mCNV进行准确的遗传学分析，全基因组测序和微滴式数字PCR最终实现了这一点，这两种方法产生的结果非常相符，”文章的资深作者，哈佛医学院的遗传学教授Steven McCarroll说。

研究人员发现，人与人之间90%已观察到的基因拷贝数差异都属于mCNV。“mCNV比人们之前估计的广泛得多，对基因剂量变异的影响也更大，” McCarroll说。“我们确定mCNV对基因表达变化有实质性的影响，也就是说它们有能力造成表型变异。”

受到多拷贝区域影响的一些基因（比如HPR1和ORM1）与疾病有关，mCNV研究有助于理解这些拷贝数改变对人类表型和疾病的具体影响，文章的共同作者Bio-Rad公司的Jennifer Berman说。

NGS分析与微滴式数字PCR

由于技术问题，传统芯片和标准qPCR难以用于mCNV研究。而NGS和ddPCR的出现大大提升了人们的遗传学分析能力。“目前能够精确分析mCNV的方法，就只有McCarroll等人开发的NGS分析法和微滴式数字PCR，”Berman说。

Bio-Rad开发的微滴式数字PCR自2011年面市以来，已经被近两百篇文献引用，是一种超级精确和敏感的PCR技术，可以鉴别目标DNA拷贝数的微小差异。

McCarroll等人将自己开发的计算方法与现有NGS数据结合起来，鉴定人类基因组中超过8,500个CNV。研究人员分析了千人基因组计划中的849个人类基因组，在他们发现的CNV中大约三分之一是mCNV。

随后，研究人员用Bio-Rad的QX200™微滴式数字PCR系统对NGS的结果进行验证。研究显示，这两种技术得出的结果高度一致。对于单个基因组而言，ddPCR定量的mCNV拷贝数与NGS达到了99%的匹配率。这种交叉验证表明，NGS和微滴式数字PCR能够可靠地定量检测mCNV，而mCNV对人类的影响是不容忽视的。