下一代测序在未来会是什么样子的？

未来这个基因组学设备或许在生活中无所不在

　　罗氏诊断最近所宣布的与拥有长读长测序技术的公司进行的合作和收购，将使罗氏逐步拥有对序列重复区域进行测序的能力，并且简化了相应的数据分析的过程。

　　目前，很多因素推动了下一代测序(NGS)市场。而在几年前，由于通量和价格等原因，NGS很难代替原有的技术。

　　而今推出的NGS已经显著降低了设备成本，简化了操作技术，使NGS已广泛应用在无创产前检测(NiPt)，肿瘤学，病毒学，耐药性测试和感染性疾病等领域。

　　今年1月15日至16日，世界各地的科学家聚集在比利时鲁汶，围绕着“NGS的革命：工具和技术”这一议题，讨论NGS的变化动态。

　　对遗传谱研究的逐渐深入有助于简化临床诊断方法，同时推动了NGS的市场。利用测序这一无创检测手段，使传统的诊断技术发生了变革。

　　罗氏诊断测序平台生命周期专家Paul Schaffer认为，每个现有的商业测序平台都有其局限性，用户需要事先评估欲购买服务的平台，诸如工作流自动化的需求，生物信息学的支持以及后续数据分析的难度。罗氏诊断最近所宣布的与拥有长读长测序技术的公司进行的合作和收购，将使罗氏逐步拥有对序列重复区域进行测序的能力，并且简化了数据分析这一瓶颈。

　　正在开发的测序平台也大大缩短了获得结果的时间，这可以使测序结果与其它检测技术得到的结果共同出现在临床报告中。如果对于其他检测技术，从样品到结果的时间是不到一周，则NGS工作流程也需要在同一时间内完成。这也得益于单分子测序可以检测到核苷酸的碱基修饰，消除了GC序列偏差，大大简化了工作流程。

　　Schaffer说，NGS的临床市场将会显著的增长。不仅是近期应用驱动了这一需求，而且目前NGS技术日趋成熟，更加方便用户，成本却持续降低。未来美国临床市场的应用比率将取决于实验室开发测试(LDTs)，相关报销和伦理准则的实施力度。

　　新思维

　　Edico Genome公司的Dragen Bio-IT Processor与现有的测序分析方法相比，大大加快了测序数据的分析速度，提高了测序结果的准确度，并且保持了分析的灵活性。

　　在NGS主要用于科研的时代，花费20小时进行数据分析是可以接受的。而今天，随着测序数据越发庞大，以及正在进行的基因组临床诊断的开发，高速和低成本的NGS数据处理显得更为重要。而DRAGEN正是一个为NGS专门开发的快速硬件平台。

　　DRAGEN在云平台或服务器集群上通过软件执行序列比对，序列排序，序列作图，序列去重和变异识别功能。数据处理器准确分析超过50个完整的人基因组只需不到一天的时间，减少了对大型服务器集群的需求，从而降低了相关的存储空间和网络技术基础设施的成本。

　　Edico Genome 的首席执行官Pieter van Rooyen博士说, “我们的周围的大量的消费电子产品，可以带给我们新的思维，而这可以将基因组学带到一个新的水平。”

　　“在80年代中期，只有少数人拥有手机，并且远不如今天移动设备的轻巧和功能强大，而手机市场规模也是很小。但这就是今天基因组学的现状，“van Rooyen博士说。“目前基因测序设备大多很是笨重。当然，我们都知道基因测序的应用是很有潜力的，但如今没有一个人确切知道基因测序最终会变成什么样子。

　　“我相信基因测序将在我们的生活中发挥巨大的作用，我们的技术只是使之成为现实过程中的一小步。基因组学可以让医疗的成本更低。但对于临床应用，必须是实时处理，所以最终将是由医生进行直接进行基因测序“。

　　我们的目标是减少对网络技术基础设施的依赖，并且避免应用多个服务器，我们希望测序在一台仪器中独立完成。目前，DRAGEN使用一台服务器，但未来，数据处理器将会集成到测序仪中。

　　临床为中心的基因组学

　　HiSeq X是将10台超高通量测序仪集合在一起，专为大规模人类全基因组测序所设计。只需 1000 美元就可完成30×覆盖率的人类基因组测序。

　　每台Illumina的HiSeq X Ten每年能够测序 18,000 个人类基因组，而每个基因组只需1000美元。Illumina战略计划部高级副总裁Alex Dickinson博士说，“HiSeq X Ten正在引领全球基因组的概念。这是一个大规模的测序过程，测序首先要到临床，再从临床到相关的研究”。

　　Dickinson博士说，英国100000基因组计划就是“由临床到实验室”方法的一个实例，由英国NHS(National Health Service)所运营和支持的这个计划聚焦于罕见疾病，癌症和传染病。

　　“尽管从根本上说，这是一个临床项目，但是它所积累的数据有巨大的研究潜力，” Dickinson 博士认为，“类似于100000基因组计划的项目前期需要巨大的投资，但随后就会带来经济利益。”

　　更多的测序将会产生更多的信息。接下来的任务就是确定采取何种方式增加关于测序的科研论文的数量，如何描述疾病和药物的关系，以及如何进行后续的应用。当然，数据的分析，将整个基因组序列转化为有用的健康建议，仍然是一个技术难题。

　　“直到有了大量可用的基因组数据，真正的大规模测序才会出现。” Dickinson 博士预言，“需要跳过鸿沟才会有思想的飞跃。能够做这件事情的第一个国家将会走在整个新行业的前列。尽管目前测序已经走向临床，但基因组序列只在临床上得以应用绝不是一个完整的方案。

　　“基因组不会在你的生活中改变，它是你的整个生物学的地图。你可以想象一个人出生后将进行基因组测序，数据将会输入到他们的医疗记录中，而包括预防保健在内的几乎所有的医疗问题都将根据他的基因组进行决策。“

　　检测所有的遗传变异

　　Cergentis提供的靶向位点扩增技术(TLA)在对感兴趣的基因进行全序列分析以及检测所有基因融合方面呈现出独特优势。它使用互补于感兴趣的基因特异序列上短位点的两个PCR引物进行扩增，这使得这段序列中无论是否发生了点突变或是结构变异，都可以对感兴趣的位点进行NGS。

　　尽管靶向基因测序和全基因组分析技术正在发展，对感兴趣的基因内部及其上下游基因进行遗传变异检测仍然是一个挑战。一种称为靶向位点扩增技术(TLA)方法利用近端序列的交联可以对全部基因进行选择性扩增和测序。

　　无论序列是否发生变化，TLA在任何基因组的感兴趣区域都可以进行靶向测序和单体型分析,并且提供所存在单核苷酸变异以及结构变异的相关信息。该技术非常适合于转基因分析中整合位点的确定，以及验证外源基因是否以适当的方式进行整合。

　　TLA使用特异于感兴趣的区域的一个引物对进行靶向扩增。对于转基因方面的应用，引物需要特异于只在外源基因中具有的序列。这种技术可以提供可能发生在转基因和整合位点的，包括所有遗传变异的完整序列信息的报告。

　　Cergentis首席执行官Max van Min表示，当前应用主要涉及与疾病诊断相关以及与感兴趣的表型相关的序列区域。实例包括应用TLA技术，对癌细胞中感兴趣的基因进行测序，并检测预后和药物反应中发生的变异，这可以为药物研发提供一系列帮助。

　　由于TLA提供了比其他技术更多的遗传信息，这也会为NGS提出一些挑战，如何去解释这些额外的遗传信息。有一些感兴趣的临床的遗传变异是已知的，但也有一些实例中，对变异进行分类以及判定变异是否与感兴趣的表型相关是非常困难的。

　　TLA最早的方案是使用全细胞作为材料。最新开发的方案也可以使用分离的DNA作为分析材料，这为基因诊断开辟了新的机会，可以对微生物，植物或动物基因组中任何感兴趣的区域进行靶向测序。

　　准确度的提高

　　Thermo Fisher公司的Hi-Q Sequencing Kits从根本上降低了酶进化研究项目的系统误差和假阳性率。

　　AmpliSeq技术应用大规模平行多重PCR进行基因组或转录组的靶向富集，只需10-15ng材料，在2-3小时内就可以完成。新的检测方法可用于分析外显子组，整个转录组，小基因和RNA组合，染色体易位或基因融合，以及拷贝数变异。多达两万条引物或转录物可以放在一个PCR管中，如果分析整个外显子组，30万条引物放在12个PCR管中就可以完成整个实验。

　　针对转录组应用AmpliSeq技术，感兴趣的RNA分子可以被特异性扩增;也可以通过定量检测不同样品中所富集的RNA或基因的数量进行样品的比较。

　　“Ion测序仪不会使用终止反应，” Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)公司生物信息学产品高级总监Mike Lelivelt博士说，“这样可以节省时间，为我们提供快速测序，但代价是有时我们对同一段核苷酸进行测序时，很难进行精确的定量。

　　“NGS的强大之处在于你获得了很多的读长和冗余序列。大量的读长使你避免了非系统性误差，给予你正确的答案。冗余序列是你的朋友。我们利用他们来清除错误的表达谱，提高了我们的准确度。”

　　Hi-Q Sequencing Kits来自于酶进化研究项目;有控制的诱变聚合酶并筛选突变体。得到的酶系统误差低，假阳性率降低了50%。减少了验证需求的同时，提供了更为精确的测序系统。

　　公开数据将应用Ion PGM测序仪及Hi-Q Sequencing Kits的 AmpliSeq技术与其他测序系统进行了比对。数据显示，对于一个肿瘤样品，Ion PGM和AmpliSeq所获得的靶标基因组合更为准确。

　　单细胞和FFPE DNA变异的分析

　　高速发展的NGS技术已经为单细胞和福尔马林固定石蜡包埋的方法处理(FFPE)DNA变异的分析提供了可能性。然而，测序前FFPE样品质量的评估以及数量有限的单细胞DNA仍是目前存在的难题。

　　在两项研究中，Qiagen的研究人员公司提出两种方法解决了这些难题，并证明了在Qiagen 的“sample-to-insight” 解决方案中如何应用这些方法以进行下一代测序。

　　在第一项研究(“基于多重PCR的靶向富集测序以进行单细胞突变检测”)中，证明了应用多重PCR靶向富集方法检测单细胞DNA中单核苷酸突变是可行的。 Qiagen相关论文的作者Eric Lader认为 “因为靶向富集方法让罕见单核苷酸突变的分析非常有效，因此这种方法非常适合于单细胞突变检测。

　　在第二项研究(“扩增基因组DNA的定性和定量——用于NGS之前进行基于PCR的靶向富集”)中，简单的实时定量PCR方法用来评估FFPE样品的质量以及针对低质量样品优化NGS条件，Lader指出，“相比于靶向少数基因组的位置的方法，两个qPCR实验靶向40个基因组位置可以有效的减少偏差”。

　　与二倍体参照序列的比对

　　NGS的出现，让利用基因组数据诊断人类疾病成为了可能。但是，对于罕见的疾病诊断来说，即使这项技术假阳性率和整体误差率很低，也可能存在问题，在某些程度上这些问题也源于应用二倍体人类基因组中的单倍体参照序列研究各种变异。

　　美国国立卫生研究院未知疾病项目(NIH UDP)认为，如果进行比对的二倍体参照序列上带有其个体，双亲以及种群的信息，序列比对以及基因型的鉴定则会更加准确。这种称为二倍体比对的方法，利用来自家庭成员的基因组单核苷酸多态性芯片数据以及来自于1000基因组计划的种群单倍型数据，创建一个可以用于比对NGS数据的个性化的二倍体参照序列。

　　这一方案在美国国立卫生研究院的Biowulf超级计算机集群上进行了开发和测试，并在Appistry公司的Ayrris 平台上进行了优化和运行。

　　“相比与单倍体参照序列进行比对，二倍体比对更有助于使短读长比对到正确的位置上，” NIH UDP项目负责人William A. Gahl博士说，“桑格验证表明二倍体比对鉴定基因型更为准确。”

　　“使用个性化的参照序列通过减少假阳性率节省了分析时间，并且帮助NIH UDP发现了因果遗传突变。”Gahl博士说，“这一方案自2014年9月已经用于作为序列比对定位和基因分型的通用平台，并在一些疾病的诊断中做出了贡献。”