利用PCR进行病原体检测是一种强大的技术，在一次检测中检测多种病原体在临床实践中至关重要。由于其高灵敏度和特异性，荧光报告器被广泛用于实时监测核酸扩增过程。然而，随着对高通量多重检测的需求不断增加，传统的基于荧光的实时 PCR 方法因仪器复杂性、光谱重叠和成本等问题而变得越来越受限。固相 PCR（SP-PCR）是一种将多种针对病原体的探针或引物固定在固体表面上形成阵列的技术，这种技术能够实现多重扩增，并减少多重检测中的信号干扰。SP-PCR 由于其具有空间编码的阵列结构，能够使用单一荧光团同时针对多个特定分析物，从而极大地增强了多重检测能力。然而，由于 SP-PCR 是在静态条件下进行的，液相中目标基因产生的扩增产物与固相特异性探针之间的相互作用和结合受到限制，可能降低 PCR 效率。此外，SP-PCR 过程中的信号读取通常在实验的末尾进行，很难实现实时检测。 近日，一组来自丹麦技术大学的研究团队在杂志npj biosensing上发表了一篇题为“Fast and sensitive multiplexed diagnostic system enabled by real-time solid-phase PCR assay”的文章。本研究报道了一种全集成微流控即时检测平台，通过将内置机械阀控流体系统与双腔室实时固相PCR技术相结合，解决了多重qPCR的光学瓶颈和传统固相PCR的效率与实时检测难题。此方法可实现20分钟内完成对5种呼吸道病毒（新冠、流感A/B、鼻病毒、副流感病毒）的多重定量检测，LOD低至10拷贝/反应、特异100%，而且仅需单色荧光读取，极大简化了光学系统。该“样本进，结果出”的平台以其结构简单、成本低廉、快速高效的特性，为临床现场多重分子诊断提供了一种极具前景的解决方案。
图片来源：npj biosensing 主要内容 实时多重 PCR 检测系统概述 作者设计了一个自动化的样本到结果的 SP-PCR 系统，用于执行多重检测，并能够实时监测固相阵列中的荧光信号。整个系统包括样本制备、扩增部分、加热部分和光学系统。将针对多个目标的特异性探针固定在固体表面上，使得使用单一荧光波长可以读取多个目标的信号。 平台由检测芯片和一个控制基座构成，并集成了新型机械阀门系统来控制流体运动（下图B）。这种刚性立方体阀在静止状态时，其内部微通道与芯片主管道错位，封闭储液库；当外部执行器按压使其垂直位移时，内部通道与主通道对齐，在负压驱动下实现精确流体输送。芯片前端集成了基于硅胶基质（Silica Matrix）的核酸提取模块。加入裂解缓冲液的病毒样本通过核酸提取模块时捕获RNA，通过微阀顺序控制各阀门，可在约3分钟内完成样品裂解、结合、洗涤和洗脱，提取效率约为61%（下图E）。洗脱后的 RNA 即可在扩增环节中用于 SP-PCR。
样品到结果的多重RT-qPCR检测。图片来源：npj biosensing 实时固相定量SP-PCR 策略 平台创新性设计了双腔室PCR系统，将传统液相扩增与固相杂交检测融合。PCR反应混合液在恒定为95°C的变性/反转录腔室（C2） 与60°C的退火/延伸/检测腔室（C1）之间，通过按压C2顶部柔性膜产生的往复运动实现“热循环”（图B和C）。 C1底部阵列上共价固定了针对不同靶标的特异性探针。反应液中使用的FAM标记正向引物在C1中参与液相扩增，产生的带荧光标记的ssDNA扩增子可与固相探针杂交，并被共价捕获在阵列上（图D）。每个循环的退火/杂交步骤结束后，反应液会被立即压回C2。C1腔仅剩已结合在阵列上的荧光产物，而游离FAM引物和溶液背景被物理移除。这将彻底消除强荧光背景干扰，简单的单通道荧光CMOS相机即可对固相阵列上的多重信号进行实时、高信噪比读取。
实时固相定量SP-PCR 策略。图片来源：npj biosensing 双腔室SP-PCR 的性能评估 作者使用新冠（SARS-CoV-2）RNA靶标验证，结果显示随着 PCR 循环次数的增加，荧光信号随之增强，且荧光强度与溶液中扩增子的浓度呈线性关系。该系统固相PCR的检测限（LOD）为 10 个拷贝/反应，PCR 效率为 83.4%（下图C）。为了缩短检测周转时间，作者还优化了退火时间至12秒（图D），不影响性能的同时极大缩短了总时长。
双腔室SP-PCR 的性能评估。图片来源：npj biosensing SP-PCR 的多重检测评估 为了进行多重检测，作者在阵列上同时固定5种呼吸道病毒探针，包括新冠病毒、甲型流感（Inf. A）、乙型流感（Inf. B）、鼻病毒和副流感（Para-inf.）病毒（下图A）。实验证明，系统能准确区分并定量检测任意组合的阳性靶标，对5种病毒的平均LOD为10拷贝/反应，阴性对照（NTC）无交叉信号。系统以38个循环为判读阈值时，阴性样本检出特异性为100%（图E–I）。从样本加载到结果输出的全过程仅需约20分钟，其中3分钟核酸提取，4分钟RT，约14分钟40个循环PCR。
SP-PCR 的多重检测评估。图片来源：npj biosensing 总结与讨论： 在本研究中，作者设计了一种可实时多重检测的固相 PCR（SP-PCR）方法，该方法通过在固体表面阵列上进行探针固定，将固相和液相扩增策略相结合。通过将内置机械阀控流体系统与双腔室实时固相PCR技术相结合，解决了多重qPCR的光学瓶颈和传统固相PCR的效率与实时检测难题。在每次扩增循环结束后，液相 PCR 溶液会主动与固相上结合的探针分离，从而消除背景信号干扰，并能够无需多通道荧光模块就实时监测 SP-PCR 信号。该系统能够快速、实时地检测和定量五种病毒病原体，检测限低至每次反应 10 个拷贝，在 20 分钟内即可完成。该平台为高通量、低成本且仪器操作简便的多重病原体诊断提供了一种有前景的解决方案。 此研究也存在一定局限性。当前验证主要使用加标RNA进行，缺乏真实临床样本的大规模验证。另外，对于极低拷贝数样本，存在假阴性风险，超过40个循环后低拷贝与NTC的区分度可能下降。最后，该方法目前针对病毒RNA设计，对于细菌DNA或其他类型核酸靶标的检测效果和流程适配性有待进一步探索。尽管仍需临床样本验证，但其设计理念和技术集成度代表了即时分子诊断领域一个重要的进步方向。此多重实时检测平台设计简单，在临床应用中既简便又经济，具有在诊所或即时检测区域广泛采用的巨大潜力。 |
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