前言 单核苷酸多态性（SNPs）和单核苷酸变异（SNVs）是影响多种生物过程的关键因素，包括蛋白质功能、疾病易感性、药物反应和进化适应。SNP和SNV的检测在遗传疾病识别、病原体耐药性评估及感染传播预防中的关键作用。尽管现有技术如基因组测序、微阵列、PCR及CRISPR诊断方法各有优势，但它们普遍存在依赖复杂设备、成本高昂、操作时间长或成本高等问题。因此，开发一种能够快速、低成本、多重检测单核苷酸突变的即时诊断技术，仍然是一个迫切的需求。 近日，亚利桑那州立和佛罗里达大学在杂志Nature chemistry上发表了一篇题为“Programmable fluorescent aptamer-based RNA switches for rapid identification of point mutations”的文章。作者开发了基于核酸适配体的不含酶RNA开关FARSIGHTs，可以快速和多重检测几乎任何具有单核苷酸特异性的靶序列。FARSIGHT探针的激活可以在5分钟内发生，与上游扩增分离。将FARSIGHTs与等温扩增相结合，可以通过强荧光输出在 attomolar下检测单核苷酸突变。使用这种方法，作者从临床唾液样本的RNA中100%准确地区分出SARS-CoV-2 Omicron变体。FARSIGHTs可以很容易地重新编程以对新出现的病原体进行基因分型，在即时传染病监测和个性化医疗保健应用中具有潜在的用途。 图片来源：Nature chemistry 主要内容 FARSIGHT 设计原理 FARSIGHT 利用了一对耦合的toehold-exchange反应，将 RNA 结合与适体茎结构形成联系起来。在没有靶标RNA时，FARSIGHT探针的荧光RNA适配体的核心茎干被一个发夹结构锁住，处于“关闭”（OFF）状态，荧光背景极低。靶标RNA存在时，首先与探针上的“对接区域”稳定结合，发生第一步toehold-exchange反应，并确立了 FARSIGHT与靶标复合物的中间状态。若靶标是野生型（WT），即使仅有一个核苷酸不匹配，也会在中间态形成一个单核苷酸“鼓包”，造成能量惩罚，从而将平衡推回OFF状态，阻止后续激活。对于正确突变靶标，释放的单链域会启动第二轮toehold-exchange反应，会导至了荧光RNA适配体核心茎干的形成。一旦适配体正确折叠，即可结合其对应的荧光分子，生成强烈的荧光信号，进入“开启”（ON）状态（图b）。 整个激活过程最快可在5分钟内发生，无需上游扩增步骤。这种多米诺骨牌式的耦合反应机制，通过精确的能量控制，实现了对单碱基差异的高灵敏、高特异性识别。
FARSIGHT 的作用原理概述。图片来源：Nature chemistry 利用 FARSIGHTs 检测突变 作者针对SARS-CoV-2 S 基因中的 P681R 突变位点设计了一个FARSIGHT检测。结果显示，引入突变 RNA 靶标后， FARSIGHT反应在 30 分钟内荧光显著增加，而野生型靶标则接近背景水平（图d、e），其 VAF 检测灵敏度可低至 0.1%（图f）。 不仅如此，作者通过在靶标RNA区域（共21个位置）逐一引入单核苷酸替换，证明FARSIGHT能够区分所有位置的单点突变，包括形成G·U摆动碱基对的突变
FARSIGHTs 检测 SARS-CoV-2突变的表征。图片来源：Nature chemistry FARSIGHTs利用不同适配体进行点突变的多重检测 FARSIGHT的设计兼容多种荧光RNA适配体-荧光分子对（如Broccoli、Corn、Red Broccoli、Pepper、Mango-III）。利用这些光谱可区分的输出信号，作者成功实现了在单管内同时检测2个、3个甚至4个不同的点突变（图b–i）。此外，通过将Mango-III适配体与生物素化荧光分子TO1-biotin结合，还实现了横向流动试纸条LFA的比色或荧光读出，为多重检测提供了更简便的方案。
FARSIGHTs利用具有不同适配体进行点突变的多重检测。图片来源：Nature chemistry FARSIGHTs可与等温扩增技术相结合以检测低浓度的 RNA 目标 通过与核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术联用，FARSIGHT能够检测浓度低至30拷贝/微升的SARS-CoV-2病毒RNA（新冠病毒的 XBB 奥密克戎亚变体），并有效区分不同的变异株（图b和c）。作者还开发了封闭试管的检测格式，在单管内完成NASBA扩增和FARSIGHT检测，简化了工作流程，降低了污染风险，检测限最低可达200拷贝/微升（图e），满足临床样本检测需求。
FARSIGHTs可与等温扩增技术相结合以检测低浓度的 RNA 目标。图片来源：Nature chemistry 临床唾液样本中 SARS-CoV-2 变异株的 SNP 识别 作者将基于NASBA的FARSIGHT双位点检测方案应用于实际的临床唾液样本。使用针对N501Y（主要变异株通用）和Y505H（Omicron特异性）的FARSIGHT，成功从12份阳性样本（经测序确认为Omicron BA.5）中检出病毒并准确分型（图c），与RT-qPCR结果完全一致，而11份阴性样本均无显著信号（图d）。
临床唾液样本中 SARS-CoV-2 变异株的 SNP 识别。图片来源：Nature chemistry 总结与讨论 作者开发了 FARSIGHTs，这是一种不含酶的单核苷酸特异性 RNA 转换器，它利用耦合的toehold-exchange反应来实现高序列特异性。在存在野生型靶标的情况下，FARSIGHTs 产生的最低背景荧光使得能够检测到突变 RNA 靶标，其变异丰度低至 0.1%。FARSIGHTs 可与多种不同的荧光适配体兼容，能够实现任意突变的单管多重检测，包括那些产生 G•U 摇摆的突变。通过与恒温扩增技术的结合，FARSIGHTs 能够检测从临床唾液样本中提取的低丰度 RNA 靶标中的突变。 对比现有技术，FARSIGHT具有诸多优势。FARSIGHT成本较低，估计每个反应成本约为1.76美元，远低于测序和某些PCR/CRISPR方法。且无需酶促信号转换，激活快（最快5分钟），设备要求简单，适合POCT应用。FARSIGHT不依赖PAM序列，可靶向RNA目标中长达21个核苷酸窗口内的任意突变，克服了CRISPR-Cas系统的靶向限制。FARSIGHT未来可应用于检测RNA修饰、小分子或蛋白质，甚至可在活细胞中进行实时突变成像，为研究DNA损伤修复、基因组突变动态等细胞生物学过程提供了强有力的新工具。 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
