CRISPR-Cas12a系统因其特异性DNA识别能力和高效的顺式/反式切割活性，在分子诊断领域展现出巨大潜力。然而，传统CRISPR诊断技术需将核酸扩增（如RPA）与Cas12a检测分步进行，以避免Cas12a对扩增模板的降解，导至操作复杂且易污染。将CRISPR裂解与核酸扩增整合到一个单管反应中，对于将基于CRISPR的分子诊断推向实际应用至关重要。但需解决以下核心矛盾：如何在不干扰核酸扩增的前提下，实现Cas12a的高效激活？ 光控策略通过化学修饰crRNA并利用光照触发其活性恢复，为这一问题提供了理想解决方案。然而，现有光控方法存在通用性差（需针对不同靶序列重新优化修饰位点）、成本高（多碱基修饰）及设计复杂等问题。 近日，杂志Nature Communications上发表了一篇题为“Identification of a key nucleotide influencing Cas12a crRNA activity for universal photo-controlled CRISPR diagnostics”的文章。作者的目标是开发一种更具成本效益和多功能的光控CRISPR-Cas12a系统。作者针对调节crRNA的直接重复（DR）区域的研究结果显示，位置RRS-4的U碱基是最佳的光响应开关碱基，并因此开发了一种通用的光控CRISPR诊断技术，只需要对crRNA进行单碱基修饰。此外，通过采用单碱基光笼split crRNA设计，光笼试剂可以预先制备并使成本降低至传统方法的1/5，可应用于几乎任何靶标的检测。
图片来源：Nature Communications 主要内容 影响Cas12a切割活性的crRNA DR区关键核苷酸 研究团队分析了Cas12a crRNA中重复识别序列（RRS）的作用。RRS是DR区内一个4核苷酸片段（AAUU），在pre-crRNA的加工过程中起着至关重要的作用。 突变实验结果显示，RRS中任何位置的突变都显著影响了顺式和反式切割活性，其影响顺序为位置4≈3 > 2 > 1。RRS第3/4位点（U）的突变几乎完全废除crRNA活性，而第1/2位点突变影响稍小（下图c-f）。分子信标实验表明，RRS突变仅影响Cas12a的切割活性，不影响其靶标结合能力，提示突变可能干扰了酶活性的结构激活。这一发现为开发单碱基光控开关提供了理论基础，通过修饰RRS第3或4位U核苷酸，可精确调控Cas12a活性。
鉴定影响Cas12a切割活性的crRNA DR区关键核苷酸。 图片来源：Nature Communications 基于crRNA单碱基光笼化修饰的 光控LbCas12a系统的开发 6-NPOM是一种光敏保护基团，可以“笼化”核苷酸碱基，暂时使其功能失活。在紫外线（365 nm）照射下，可以迅速去除该基团，恢复核苷酸的生物学功能。作者采用6-NPOM光笼化修饰RRS的U碱基，尝试开发一种简单通用的单碱基光开关策略。结果显示，当对RRS位置4（RRS-4）进行单碱基修饰时，可完全抑制活性，且光照后恢复效率达野生型水平（图d）。当对RRS位置3（RRS-3）进行光笼修饰时，活性抑制有效，但光激活后恢复率仅20%。通过凝胶电泳和荧光检测验证，RRS-4修饰在顺式/反式切割中均表现出最优的光控性能。因此RRS的4号位置可作为单碱基光调控设计的最佳位置，且仅需单次修饰即可实现通用性调控，显著降低成本与设计复杂度。
基于crRNA单碱基笼修饰的光控LbCas12a系统的开发。 图片来源：Nature Communications split crRNA介导的单碱基光调控策略提升通用性 先前的研究表明，Cas12a可以招募split crRNA进行靶标识别和切割，可保留与全长crRNA相当的检测性能。为进一步简化crRNA合成，团队开发了split crRNA系统。将crRNA拆分为10-nt DR片段（含RRS-4修饰）和26-nt片段（含间隔区），两者联合仍保留完整活性。10-nt DR片段，含有光笼修饰物，可作为通用序列预先合成，仅需针对新靶标合成26-nt片段，成本降低80%以上。 反式切割和顺式切割实验证实，split crRNA可检测低至1 pM的dsDNA靶标，与全长crRNA相当（图d-i）。该策略成功将光控元件与靶标识别元件解耦，实现了“通用光控模块+可编程检测模块”的灵活组合。
split crRNA介导的单碱基光调控策略提升通用性。 图片来源：Nature Communications 光调控单管Cas 12a系统的临床应用 基于上述发现，团队构建了光控单管RPA-Cas12a检测系统。先将光笼化crRNA、Cas12a、RPA试剂与样本混合，37℃扩增10分钟后，紫外光照30秒激活Cas12a，实时监测荧光信号。 使用肺炎支原体（MP）基因片段为靶标评估系统性能，结果显示，单碱基光笼split crRNA系统的检测限达1 aM。这一系统还成功检测了SARS-CoV-2、EBV、HPV18等5种病原体，均实现1 aM灵敏度。上述结果表明，该单碱基光笼split crRNA系统兼具高灵敏度及通用性。 作者收集了35例疑似MP感染患者的咽拭子样本，并使用标准化提取系统提取核酸。临床样本测试（35例MP疑似患者）显示，分裂crRNA系统与全长crRNA系统的阳性符合率96.7%（29/30），且无假阳性。使用先前开发的便携式光控荧光检测仪结合Chelex-100快速核酸释放技术检测14个咽拭子样本时，便携式设备成功检测出9个阳性样品和5个阴性样品，灵敏度和特异性均达到100%。从样品输入到结果的总周转时间约为20分钟。便携式装置实时荧光曲线与专业荧光定量PCR仪获得的荧光曲线高度一致（图f）。
光调控单管Cas 12a系统的临床应用。 图片来源：Nature Communications 总结与讨论 在这项研究中，作者系统地研究了重复识别序列（RRS）突变对切割活性的影响，RRS是Cas12a crRNA直接重复（DR）区域内的一个四核苷酸片段。作者观察到4号位置的光笼可以最有效地抑制酶活性和最佳的光介导激活。利用这一发现，研究团队开发了一种光控CRISPR诊断方法，实现了一种普遍适用的单管检测策略，这种预先准备的试剂可以适用于几乎任何靶基因的检测。 本研究开发的单碱基光笼split crRNA系统成本低，合成成本降低至传统方法的1/5。光控模块与靶标序列无关，适配任意病原体检测，具有极高通用性。单管反应避免污染，适合POCT场景。该技术不仅推动了CRISPR诊断的实用化，也为光控基因编辑工具的开发提供了新思路。 |
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