细胞因子检测下限可达 1~2 nM！

近日，杂志Communications biology上发表了一篇题为“Optimised nanobody-based quenchbodies for enhanced proteindetection”的文章。本文介绍了一种基于纳米抗体的优化型淬灭体（quenchbody），用于增强蛋白质检测的性能。通过理性设计和分子动力学模拟，研究人员在纳米抗体的互补决定区（CDRs）中引入了色氨酸残基，可显著提高淬灭体在抗原结合后的荧光强度增加倍数。这种优化型淬灭体在检测人类炎症细胞因子IL-6时，表现出1.5至2.4倍的荧光增强，检测下限可达1-2 nM。本文不仅为开发针对多种蛋白质目标的生物传感器提供了有价值的平台，还在研究、诊断和环境监测等领域具有广泛应用前景。

淬灭体（quenchbody）通常是单链可变区(scFv)或抗原结合片段(Fab)的抗体，通过柔性肽与荧光团连接。这种柔性肽允许荧光团与淬灭体中的色氨酸残基相互作用，导至荧光强度显著降低（图A）。当淬灭体与其同源抗原结合时，荧光团与色氨酸的相互作用在空间上受阻，导至淬灭体的荧光强度增加。这种方法可以在复杂生物样本如人类血浆中快速测量抗原的浓度。

为了开发基于纳米体的高性能淬灭体支架，作者选择了抗麦芽糖结合蛋白（MBP）和溶菌酶作为初始支架，并进行了分子动力学（MD）模拟。对于MBP结合纳米体，互补决定区（CDR）中含有三种固有色氨酸，荧光团在距离色氨酸≤10 Å处的平均模拟时间，抗原未结合状态为70.7%，抗原结合状态为0.1% 。溶菌酶结合纳米体在CDR中含有两种色氨酸（W103和W115），荧光团在距离色氨酸≤10 Å处的平均模拟时间，未结合状态下为37.3%，在抗原结合状态下的平均时间比例为5.9%。

为了测试淬灭体的性能，作者测定了存在或不存在抗原时荧光的变化。Qb-MBP在≥100 nM MBP时可检出最大1.5倍荧光增高，低至4 nM MBP时检出具有统计学意义（图A）。≥1000 nM溶菌酶时观察到Qb-Lys最大1.3倍荧光增高，低至1 nM溶菌酶的检测具有统计学意义（图B）。Qb-MBP的EC50为14 nM， Qb-Lys的EC50为7 nM。实验验证表明，实验数据与计算机模拟结果一致。

为了验证溶菌酶淬灭体中色氨酸的作用，作者用酪氨酸取代W103和W115，创建了Qb-Lys变体W103Y、W115Y和W103Y/W115Y。实验结果显示，W103，而非W115在淬灭机制中发挥了重要作用（图B）。这些数据表明CDR色氨酸对淬灭体的表现最为重要。

作者还以MBP淬灭体为目标，确定了对淬灭最重要的色氨酸为W101、W110和W115（图E）。作者最终确认了对溶菌酶和MBP淬灭体的传感性能有良好贡献的色氨酸为W59、W101、W103、W110和W115。

作者生成了一个优化的淬灭体支架，色氨酸位于CDR2中的第59位，CDR3中的101、103、110和115位，形成一个凸形的多色氨酸表面（图A），并以此为基础对IL-6淬灭体进行定向进化。对这些淬灭体进行筛选，筛选出11个高性能淬灭体。变异#15的EC50为20 nM，显著检测至1 nM，而变异#35的荧光增加2.4倍，显著检测至2 nM。这些数据表明，CDR -色氨酸优化合成纳米体支架是通用的，在检测未来感兴趣的蛋白质靶点时，可用于生成具有高传感性能的特定淬灭体。

本研究揭示了纳米抗体淬灭体中色氨酸残基在荧光淬灭和恢复中的关键作用。与基于ScFv和Fab的淬灭体不同，纳米抗体基淬灭体的荧光淬灭主要由与抗原直接接触的CDR区色氨酸残基介导。这一发现为进一步优化淬灭体性能提供了重要依据。优化后的淬灭体在检测IL-6时表现出色，为开发针对多种蛋白质目标的生物传感器提供了有价值的平台。这种淬灭体不仅具有高荧光增强倍数和低检测下限，还具有快速进化、易于生产和完全合成等优点。

未来研究将进一步探索淬灭体的应用潜力和优化策略，以推动其在临床诊断、生物标志物检测和环境监测等领域的应用。