新工具：面向高度变异病毒组学量身定制

近日，杂志Nature communications上发表了一篇题为“varVAMP: degenerate primer design for tiled full genome sequencing and qPCR”的文章。作者介绍了为病毒基因组学量身定制的varVAMP工具，可以为单个扩增子、tiled扩增子和qPCR设计简并引物。作者通过设计和测试SARS-CoV-2、HEV、ratHEV、HAV、Borna-disease-virus 1 （BoDV-1）和脊髓灰质炎病毒（PV） 1-3的泛特异性tiled和qPCR引物，展示了varVAMP的实用性，且最小化引物错配方面，varVAMP优于主流引物设计软件PrimalScheme和Olivar。

varVAMP（Variable Virus Amplicons）是一款面向高度变异的病毒序列，针对qPCR或tiled扩增子全基因组测序的简并引物设计工具。该工具依赖于病毒序列的多重序列比对（MSA）分析、k-mer筛选算法和Dijkstra算法等关键技术，能够识别出保守区域并设计包含简并核苷酸的引物，从而最大限度地减少引物与靶序列之间的错配。

作者尝试设计对多种HEV-3亚基因型具有特异性的引物。作者首先对HEV序列进行相似性聚类，并得到7个聚类，其中4个聚类属于HEV-3。作者使用varVAMP为聚类2（HEV- 3 f, e）和聚类4（HEV- 3 c, h1, m, i, uc, l）设计引物，产生了数个1 - 1.5 kb的tiled扩增子测序引物设计。单步RT-PCR结果显示，除了2个引物产生了非特异性扩增，其余扩增子都有一致的强扩增。作者使用此tiled引物方案，通过Illumina测序从感染细胞培养物和患者材料中恢复了接近完整的病毒基因组（如下图）。

作者还使用varVAMP设计了SARS-CoV-2、BoDV-1、HAV、PV和ratHEV的全基因组tiled测序引物方案，并在计算机上对这些方案进行了评估。varVAMP的主要目标是感知变异，并在最大化扩增子覆盖率的同时最大限度地减少引物与输入MSA序列的错配。为了评估varVAMP在变体感知方面的性能，研究团队将其与PrimalScheme和Olivar等主流引物设计软件进行了头对头比较。结果显示，在处理高度变异的病毒序列时，varVAMP在最小化引物错配方面表现最佳。这主要得益于varVAMP能够将变体信息整合到引物序列中，从而提高了引物与目标序列的结合能力（下图a，b）。

在一项由各自病原体专家参与的多中心研究中，作者评估了针对SARS-CoV-2、BoDV-1、HAV、PV和ratHEV的varVAMP引物是否适合全基因组测序和基因组重建。结果显示，所有引物方案均适用于Illumina或ONTtiled扩增子测序，并通过应用最初为SARS-CoV-2 tiled扩增子测序而开发的测序方案获得高度覆盖的全基因组序列（如下图）。

varVAMP是一款功能强大的生物信息学工具，它能够为高度变异的病毒设计高效的引物方案，适用于tiled扩增子全基因组测序和qPCR等多种分子技术。通过实验验证和与其他软件的比较，研究团队证明了varVAMP在变体感知、引物错配最小化以及运行时间等方面的优势。未来，随着病毒基因组的不断演化和新型病毒的出现，varVAMP有望为病毒诊断和流行病学研究提供更加可靠和高效的工具支持。