低成本、1小时，结核病POCT诊断新方法

作者开发了一种成本低廉且便携的LIT（lab-in-tube）设备，用于检测血液、唾液和痰等多种样本中的结核杆菌DNA。该方法中，首先收集呼吸道样本到检测管中，并转移到便携式设备中进行样本裂解及失活。接着，移动LIT柱塞，将裂解液加载到DNA捕获膜上，启动RPA-CRISPR反应。反应完成后，将试管移至读出端口，检测荧光信号（图A)。整个试验过程共需要约1小时来执行热样品裂解、RPA-CRISPR孵育和荧光成像步骤，返回试验结果。

作者优化了单管RPA和CRISPR检测条件，选择最佳反应温度、Cas12a酶、反应缓冲液和gRNA浓度，对CRISPR反应进行了调整。结果显示，在不添加CRISPR缓冲液且含有42 nM浓度的Cas12a/gRNA2 + 3复合物的反应中，37°C条件下检测到了最大信号，所有后续实验均采用这些条件。

作者还评估了几种基质在保持冻干测定试剂活性方面的能力。研究发现基于棉的滤纸基质中检测到的复溶后CRISPR信号更强更稳定，从而被选为RPA-CRISPR测定的最佳试剂基质。经过优化，RPA-CRISPR试剂在2个月内，4°C和RT储存的试剂样本与−20°C条件下储存的试剂活性相差不大。然而3个月后，RT储存的试剂产生的信号会显著减少（下图D）。

使用从健康血清中提取的DNA并加标Mtb基因组DNA进行LIT-TB检测，结果显示在0.05至5000 pg/μl的范围内表现出广泛的线性范围（图H和I），且有较强特异性，不会检测出其他分枝杆菌基因组DNA（图J)。

另一种测定方法可检测到与结核分枝杆菌对利福平抗性相关的常见SNP（rpoB S450L）（图K）。为了实现单核苷酸特异性，采用了两种方法：首先，将gRNA的“种子”区域与该突变对齐；其次，通过在保守序列区域引入一个单核苷酸错配来修改gRNA序列，这样Cas12a与野生型等位基因的结合就需要额外的gRNA错配。

作者使用从多米尼加共和国一个儿科结核病队列分析了LIT-TB的性能，包括27名被诊断为肺结核或早期肺结核的儿童。结果显示，血清LIT-TB显示出对结核病(81%）、肺结核(83%）和肺外结核(75%）具有高敏感性，均高于通过痰液、诱导痰液或胃灌洗培养以及Xpert的结果（下图A）。研究还发现，LIT系统在治疗监测中具有潜在应用价值。随着治疗的进行，患者血清中的Mtb DNA信号逐渐降低，与临床症状改善一致（图C和D）。

作者对15名确诊为结核病的成人和15名未检测到结核分枝杆菌感染的成人进行了唾液样本分析。分析结果显示，检测到了11个真正的阳性信号（灵敏度73%），且没有假阳性结果（特异性100%）（图D)。但结核病阳性样本的荧光信号差异较大（图E)。对36名疑似结核病的成人进行分析时，LIT-TB的诊断敏感性非常高（100%），特异性也很高（90.3%）（图F)。LIT系统在治疗监测中，两名在治疗开始后≤2周和≥6周收集痰液的患者，随着治疗的进行，信号逐渐减弱（图H)。

作者报告了一种廉价（每个样品约2.70美元）、手持式、电池供电的LIT结核检测方法，该方法可检测患者血清、唾液和痰样本中的结核分枝杆菌（Mtb） DNA，从样本到答案的时间不到1小时。该检测法将痰液或唾液样本的液化、Mtb病毒裂解、重组聚合酶扩增（RPA）及CRISPR检测步骤整合到一个一次性试管中，由便携式检测设备进行处理和分析。检测结果显示，与培养和GeneXpert MTB/RIF检测（55%和68%）相比，对肺部和肺外结核病的检测具有更高的敏感性（81%），并且具有良好的准确性。这表明，这种方法在资源有限且当前方法覆盖不足的环境中，作为即时检测（POC）测试用于结核病诊断具有巨大潜力。

进一步的研究应解决本研究的局限性。此检测方法未能达到WHO关于POC的最低储存要求，但通过优化冻干条件，使用能够稳定RPA和Cas12a酶活性的辅料，可能实现目标稳定性。该系统在资源有限地区具有广阔的应用前景，有望提高结核病的诊断率和治疗成功率。未来研究将进一步优化系统性能，探索其在结核病全程管理中的应用价值，为全球结核病防控贡献力量。