替代PCR，RPA成为致病菌检测的得力工具

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

在今年发表的一系列文章中，RPA技术被广泛用于结核杆菌、耐药菌MRSA、沙门氏菌等常见致病菌的检测。在临床诊断和食品安全方面，为人们提供了简单快速的实地筛查方案。

艰难梭状芽孢杆菌（C.difficile）是一种会引起感染性腹泻的重要致病菌。日前，研究人员以这种致病菌的毒力基因tcdB为靶标，开发了一个低成本的微流体RPA平台，文章发表在十月二十三日的《Analyst》杂志上。这个检测C.difficile的RPA分析芯片只需要6.4μL的初始样本，能够对扩增反应进行实时监控。

据估计，世界上约三分之一的人体内潜伏着结核病（TB）的致病菌，这些致病菌大多在肺部处于休眠状态。改善检测方法帮助TB诊断，被WHO列为公共建康的首要问题之一。RPA作为一种常温的快速DNA 扩增法，为资源匮乏的地区提供了检测TB的简便工具。研究人员在RPA的基础上，快速检测了结核分枝杆菌复合群MTC的DNA（IS6110和IS1081）。在39°C的环境下，RPA检测能在20分钟内得出高灵敏度的结果。进一步研究表明，在检测TB感染者的肺部样本时，RPA检测比荧光显微镜检测还要准确。

抗生素滥用现象使耐药菌日渐增多，目前这已经成为了一个全球性的公共健康问题。作为一种重要且危险的致病菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA一直是临床治疗中的棘手问题。在对MRSA进行DNA检测的时候，引物只能靶标一个多变的染色体区域，SCCmec。今年七月的《Plos one》杂志上发表的一项研究，通过多重RPA反应筛查了726个MRSA分离物。研究人员通过二代测序发现，24个RPA未检出的分离物中出现了新的插入突变，需要重新设计扩增引物。这一结果说明，临床上的MRSA筛查不能完全依赖DNA检测。

《Microchimica Acta》杂志今年二月的一项研究，展示了能够同时扩增和检测三种病原体的RPA芯片，包括淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙门氏菌（Salmonella enterica）和MRSA。这种芯片可以在二十分钟以内完成三种病原体和对照质粒的检测，S.enterica和MRSA的检出限可达10CFU，N.gonorrhoeae的检出限可达100CFU。这项研究中的RPA芯片，有望成为实地筛查重要致病菌的简便工具。

RPA在食品安全领域的应用

产志贺毒素的大肠埃希菌STEC是世界范围内最严重的一种食源性致病菌。《FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE》杂志今年七月发表的一项研究，在RPA的基础上首次建立了等温实时的STEC检测体系。研究人员设计并评估了一系列引物和荧光探针，实现了很高的特异性和灵敏度。

沙门氏菌是一种主要的食源性致病菌。《Analytical Chemistry》杂志今年三月份发表的一项研究，将TwistFlow®沙门氏检测整合到微流体装置中，构建了检测沙门氏菌DNA的一体化分析系统。这一微流体装置整合了致病菌检测的三个主要步骤（DNA提取、RPA扩增和结果检测），能够在三十分钟内以全自动的方式完成检测。人们可以直接通过侧流层析试纸条看到沙门氏菌检测的结果。研究显示，这种装置。对PBS和牛奶的检测下限分别为10CFU/ml和100CFU/ml。

PCR-ELISA已经是一个用途相当广泛的成熟技术。《Analytica Chimica Acta》杂志今年二月发表的一项研究，首次用RPA取代了PCR，将快速的常温扩增、生物素/链霉亲和素体系、和比色法免疫分析结合起来。这种RPA-ELISA分析法可以用来筛查食品中的安全隐患，比如过敏原（榛子、花生、大豆、蕃茄和玉米）、转基因成分（P35S和TNOS）、致病菌（Salmonella sp.和Cronobacter sp.）以及真菌（Fusarium sp.）。这项研究显示，RPA-ELISA在上述应用中均得到了令人满意的结果，有着很高的灵敏度和可重复性。

RPA反应需要在怎样的温度下进行?

标准TwistAmp®试剂盒的运行温度在37°C - 42°C之间。温度超过42°C会使酶的活性受到影响。RPA反应在低于37°C的条件下也能进行，不过TwistAmp®试剂盒已经针对反应速度进行了优化，不一定支持超出范围的温度条件。为了获得更好的效果，TwistDx公司推荐用户在40°C下使用于逆转录试剂盒。

RPA反应能实现多重化么?

可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。

RPA反应需要在特殊仪器上进行么?

不需要。对TwistAmp®基础试剂盒和nfo试剂盒而言，只要温度能控制在37-42°C之间就行。进行实时监控的体系(如TwistAmp® exo试剂盒)，需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。

RPA反应能对模板进行定量么?

可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。

此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。

扩增产物能在琼脂糖凝胶上分析么?

可以，TwistAmp®基础反应、TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通过跑胶进行终点分析。不过TwistAmp® exo不行，因为该系统里的外切核酸酶会消化扩增子。

扩增反应能进行荧光终点分析么?

可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。

RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么?

支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。

能用插入性染料实时监控RPA么?

可以。插入性染料可以在RPA反应中进行定量和监控。不过，这种染料可以结合任何双链DNA，会生成来自引物的假阳性信号。由于RPA扩增在常温下进行，这种噪音会比PCR严重一些。此外，不推荐把插入性染料用于TwistAmp® exo体系，因为体系中的核酸外切酶会在反应过程中切割扩增产物。

RPA试剂能制成master-mix么?

可以。在进行DNA检测时，可以把重悬缓冲液、引物和探针混合在一起，重悬冻干的RPA pellets。然后将不同DNA加入反应体系，最后用MgAc起始反应。在进行引物筛选时，可以用重悬缓冲液、模板DNA、探针和一个引物制成master-mix，将其分装到1.5 ml小管之后再分别加入不同的引物。注意：只有当两个引物都存在时，才能重悬冻干的RPA pellets，否则重组过程就会有偏向性。

跑胶之前需要回收RPA产物么?

需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，如果不进行产物回收，跑出来的带会出现拖尾。

RPA反应的扩增子能保存么?

TwistAmp® Basic或nfo的扩增产物可以保存，短期可以放在4°C，保存时间较长的话建议放在-20°C。

TwistAmp® exo (RT)的扩增产物不能保存。因为扩增停止后如果没有及时失活，外切酶III会快速消化扩增子。

TwistAmp® 基础反应的扩增子能进行TA克隆么?

TwistAmp®基础反应中的聚合酶没有编辑功能，扩增子应该是可以用于TA克隆的。不过TwistDx公司还没有针对这项应用进行过测试。

能直接用标记的探针和TwistAmp®基础试剂盒进行侧流层析检测么?

可以。你可以用两个经过修饰的引物来进行侧流层析检测(LFD)。不过TwistDx公司推荐使用探针和TwistAmp® nfo 试剂盒。这是因为RPA跟PCR差不多，也倾向于形成引物二聚体。如果引物不完美，很容易发生交叉反应，生成假阳性结果。而TwistAmp® nfo体系能够避免这个问题。

在用侧流层析试纸进行检测时需要稀释RPA产物么?

是的。RPA反应中的一些物质会干扰试纸上的抗体，如果不能充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。

在TwistAmp® exo (RT)反应即将结束时荧光急剧增强，这正常么?

是正常的。在TwistAmp® exo反应中，聚合酶和核酸外切酶III处于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽，核酸外切酶III开始占据优势，结果导至荧光信号出现剧增。