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新说| 人体微生物
tNGS黑与白系列写了四期，重点在技术差异部分的描述，七七八八也写的差不多了。回过头来看，无论是mNGS还是tNGS，都是病原NGS领域的重要技术，两者在很多方面具有相似性。因此，从本章开始，我们谈一下两个技术共通的内容。本篇先从两者都会检测并报告的耐药基因讲起。
- 瞎报告这么多耐药基因，医生都没有药可以用了，乱来！
- 这个样本mNGS检出耐药基因提示CRE，跟检验科药敏结果高度一致哦！
- 这个患者救过来了，你们的耐药基因检测很准哦，快速而且有用药提示！
以上是来自临床&检验关于耐药基因的一些反馈，在这些或刺耳或鼓舞的声音中，应用NGS技术检测病原并报告耐药基因，经历了“质疑批判、乱象丛生”到“初步认可推荐”的过程。mNGS检测是无差别的随机测序。作为被测序目标的一部分，耐药基因理论也可被测序到。那么将测序后的数据与耐药基因数据库比对后，识别出特定的耐药基因顺理成章。即使对于后起之秀tNGS，对于有检测需求的重点耐药基因，也可通过设计引物或探针进行检测，再进行后续类似mNGS的生信分析过程识别。现状一：定植与感染的评估方法尚未明确，NGS用作有菌部位的耐药基因检测有争议。为什么呢？因为对于正常有微生物定植部位取材的样本，耐药基因检测的需求位于第二位。临床第一位的需求首先是综合各种线索判断检出的微生物是定植还是感染。当考虑是感染时，才会诞生对耐药与否的检测需求。在定植还是感染这一大难题还未有明确的解决方案之前，有菌部位的耐药基因检测属于诊断依赖型。也就是说，医生诊断患者感染某病原菌了，用药要考虑耐药情况时，耐药基因检测有需求。如果医生判断患者检出的病原菌是定植的，那对应病原菌的耐药基因检测多么精准都属于无用功。当然，对于无微生物定植部位取材的样本类型，如血液、脑脊液、心包积液等，其耐药基因检测的需求更大，诊断价值也更高。现状二：NGS耐药基因检测走向应用最早源于mNGS技术的临床实践。然而起始阶段，mNGS检测耐药基因还没有很多循证医学证据和实践经验。mNGS应用早期敢吃螃蟹的人少，其次第一梯队应用该技术的人还没有分享吃螃蟹的方法、也还没有点评螃蟹的美味程度（ps：也许病原NGS领域缺乏一个面向临床的大众点评，哈哈）。所以很多人望而却步，对mNGS检测耐药基因到底能不能行打了一个问号。这是面向新技术的常有心态，也是新技术发展的必然路径。另外，NGS技术用于耐药基因检测面临两大亟待解决的问题：一是当NGS报告同时检出多种疑似病原菌时，如何确定耐药基因的来源；二是检出耐药基因后，基因型与表型的一致性有多高，其预测性能是否足以指导临床用药。技术的理论与实践论战必不可少。上面我们分析了耐药基因被质疑的背景。短期内定植与感染不是耐药基因检测能回答的问题。针对现状二抛出的两个问题，NGS技术如何回答耐药基因检测可靠性的问题以及回答的如何呢？问题一：如何回答耐药基因的来源进而锁定耐药菌？这个问题应该是无需培养的NGS检测面对的一大挑战。通常情况下，一份呼吸道样本会检出诸多疑似病原菌。而此时检出的耐药基因就会面临一对多的难题，究竟是来自于这两种、三种、甚至四种疑似病原菌的哪一种。为什么会这样？原因是耐药基因与耐药菌并非一一对应关系，它不仅可以通过含有耐药基因的质粒在耐药菌之间传播，也可以来源于环境，试剂背景中的背景菌，与样本中的病原菌毫无关联。举个例子，假设NGS同时报告了金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，并且也检出了耐药基因mecA。那mecA到底是金黄色葡萄球菌来源还是表皮葡萄球菌？这一判断就极为关键。因为这两种菌的致病强弱，感染场景明显不同。其中携带mecA的MRSA感染（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）所导至的临床危害更大，防控要求更高。而表皮葡萄球菌作为人体皮肤和黏膜表面常见的定植细菌，其致病性弱于金黄色葡萄球菌。如果不做mecA的准确归属判断，认为mecA就是金黄色葡萄球菌来源，武断诊断MRSA将会导至抗生素的滥用。相反，认为mecA是表皮葡萄球菌来源，武断诊断MRSE（耐甲氧西林表皮葡萄球菌）可能耽误患者病情。在感染诊断大致遵循“判断感染与否、进一步探寻感染的病原菌、明确病原菌后进行耐药评估和用药治疗”的诊疗范式下，耐药基因的辅助诊断需要与病原菌关联。那当前NGS如何克服这一困难的呢？具体的方法笔者不便细说，但当前应用特定耐药菌-特定耐药基因载量正相关的逻辑，可以建立模型较好的解决重点耐药菌与关键耐药基因的对应问题。并且当前主要的检测单位在报告中除呈现疑似病原菌、耐药基因检出序列外，会多出一列耐药基因可能来源的呈现。如此报告便是对耐药基因来源问题的产品化解决方案。第二个问题：检出如此之多的耐药基因，基因型与表型的一致性有多高，预测性能是否足够指导临床用药?笔者认为答案是：大部分耐药基因的临床价值不明确或需要探究，但是少部分已经商业化产品中的耐药基因类别具有明确耐药与否预测价值。比如提示CRE(耐碳青霉烯的肠杆菌目细菌)的耐药基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和OXA-48，提示MRSA的耐药基因mecA等均具有明确的预测价值。因此，虽然耐药基因数据库有几千种耐药基因，但当前真正有价值的仅有数十种，不应该一揽子不加识别进行报告。通过充分的调研以及研发评估选择此类耐药基因报告将会发挥NGS优势。但是，我们也曾经一度看到一份报告中几十种耐药基因同时报告的乱象。一方面此类报告不仅让临床产生误解，陷入用药困境。另一方面，这种不加甄选的报告方式反而被包装成“数量优势”，令人汗颜。不过，随着时间推移，NGS耐药基因的报告越来越规范化，我们也在NGS共识中看到如此陈述“重点关注碳青霉烯酶、超广谱 β‑内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）等耐药基因和病原体”。总之，在医疗场景下，针对NGS的耐药基因报告方案，笔者依然认为应该遵循“少即是多”的原则，重点关注临床重要的耐药菌，尤其关注“ESKAPE”在内的常见耐药菌以及其对应的有菌种特异性的耐药基因。报告可靠的耐药结果远比一通乱报引发的信任危机更好。正如共识指出“临床怀疑特定耐药菌感染，并且耐药基因与耐药表型关联性强时，可考虑送检tNGS，作为常规方法的补充”。以上，我们探寻了病原NGS耐药基因检测被质疑的背景以及对应的解决方案。那后续NGS耐药基因检测逐步被临床&检验推荐认可，又是为什么呢？笔者认为也源于以下两大原因。原因一：NGS技术检测快速且敏感性高，满足了通过基因型快速提示表型是否耐药，部分指导临床用药的需求。既往常见耐药菌的耐药评估非常依赖于培养，而培养的阳性率较低且时间较长，疑难危重患者急需检测结果指导用药，却不能及时得到耐药结果。在这样的背景下，NGS耐药基因检测横空出世，满足了临床诊断需求。原因二：重点耐药基因准确性高。一方面，对于临床重点关注的耐药菌，其检出的耐药基因型别与表型一致性很高，已经被不少文献和实战论证。另一方面，NGS技术覆盖的特定病原体比如结核分枝杆菌的耐药基因位点广、准确性高，不局限于单个且昂贵的耐药基因（如利福平耐药基因rpoB）PCR检测。比如tNGS已经被WHO纳入耐药结核检测指南。共识也做出如此的描述，即“结核分枝杆菌培养和药敏试验时间长，建议 tNGS 用于呼吸道标本的结核分枝杆菌鉴定、耐药基因及其突变位点的检测”。应用病原NGS技术进行耐药基因检测并临床报告，起于mNGS技术，在tNGS技术逐步被发扬光大。尤其扩增子tNGS在结核分枝杆菌及其点突变耐药检测方面展现出不可替代的应用价值。一路走来，NGS技术检测耐药基因饱受争议。如今，依旧还在探索之路，还尚未解决定植与感染的前置问题，同时受限于技术的灵敏度没有检出耐药基因并不代表不耐药，但作为“额外奖励”却为需要的疑难危重症患者带来诊断线索。NGS耐药基因检测的前景是怎样的呢？笔者认为，前方依稀可见一条布满荆棘的小路，仍需循着光芒前行。
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