立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索
小桔灯网 门户 资讯中心 产品杂谈 查看内容

IVD前沿丨为了提高Simoa的灵敏度,大佬都做了哪些努力

2024-6-7 10:21| 编辑: 归去来兮| 查看: 517| 评论: 0|来源: 小桔灯网 | 作者:净姐

摘要: 更进一步介绍4种提高检测灵敏度的方法。


2023年12月份Simoa技术发明人David R. Walt作为通讯作者在国际重要肿瘤期刊杂志Cancer Discov上发表文章Ultrasensitive Detection of Circulating LINE-1 ORF1p as a Specific Multicancer Biomarker,文章不仅仅介绍了ORF1p作为肿瘤新型标志物的特异性等信息,更进一步介绍4种提高检测灵敏度的方法

LINE-1 (Long INterspersed element -1)开放阅读框1蛋白(ORF1p)是一种可转座元件蛋白,在癌和高危癌前组织中过度表达,在正常组织中几乎不表达,是多种常见的、致命的癌症及其组织和血液中的高危癌前物的高度特异性生物标志物。低至25 μL血浆的超灵敏ORF1p检测是一种新型、快速、经济有效的癌症检测和监测工具。

ORF1p在肿瘤组织中的高表达很容易通过免疫染色检测到,但ORF1p在血浆中的浓度较低,远低于常规临床实验室方法的检测限。在本研究中,作者评估了多种癌症中ORF1p血浆水平的情况,迭代开发了在早期或微小残留病检测中具有潜在应用价值的高灵敏度检测方法,并提供了血浆ORF1p可能是治疗反应的早期指标的证据。


第一代超灵敏检测方法

Simoa

优化了之前报道的ORF1p Simoa检测,并评估了晚期癌症患者治疗前血浆中ORF1p水平的情况。这种“第一代”检测方法使用重组单域骆驼纳米抗体(Nb5)作为捕获试剂,使用单克隆抗体(Ab6)作为检测试剂,其检测限为0.056 pg/mL (~ 470 aM三聚体ORF1p),对应于样品稀释校正后血浆中的1.9 fM。通过这一检测,我们调查了多种癌症类型和>400名“健康”对照个体,这些人向生物样本库捐献血液时未患已知癌症。血浆ORF1p似乎是一种高度特异的癌症生物标志物,在约99%的对照组(年龄20 ~ 90岁)。在检测到ORF1p的5例对照患者中,ORF1p最高的1例在6个月后被发现为晚期前列腺癌,19个月后被发现为皮肤t细胞淋巴瘤;另外4个阳性“健康”个体的临床信息有限。


第二代超灵敏检测方法

Simoa平台应用重组兔单克隆抗体和工程骆驼纳米抗体

通过降低检测下限来提高血浆检测灵敏度的可能性。作者开发了一组亲和ORF1p的试剂,包括新的重组兔单克隆抗体(RabMAb)和工程骆驼纳米抗体。由于ORF1p是同源三聚体,作者设计了多聚体纳米抗体试剂,目的是通过增加亲和力来提高结合亲和力。虽然第二代检测法的分析灵敏度与第一代检测法相比改善了不到一个数量级,但在一个大型健康和癌症患者队列的重新测量样本中,与缓冲液中的背景相比,循环ORF1p可检测性有了显著改善。这种差异可能是由于循环ORF1p表位的可及性不同或血浆中不同的非特异性结合模式所致。第二代检测法显示出更高的灵敏度,同时保持了高特异性,显著地实现了对6例I/II期患者中的5例的>98%特异性的检测。


第三种方法

Simoa平台应用ORF1p纳米抗体

为了进一步验证以上的结果,作者开发了一种靶向蛋白质组学方法来测定亲和力捕获后的ORF1p,用两个不同的肽和内部同位素标记的对照肽进行测定。在第二代检测中通过纳米抗体工程进行改进的基础上,作者开发了一套扩大的同型二聚体、异源二聚体和异源三聚体抗orf1p纳米抗体,并将其与34H7和62H12捕获抗体进行了筛选,从而形成了“第三代”检测。


第四种方法

应用MOSAIC平台增加样本体积

为了利用更敏感的ORF1p检测方法,接下来在作者最近开发的MOSAIC平台上进一步提高检测的灵敏度。与Simoa中的微孔阵列相比,MOSAIC从单个捕获的分子中获得所有的磁珠上信号,并通过增加计数磁珠的数量来提高分析的灵敏度,比Simoa高出一个数量级。此外,由于Simoa检测法仅使用25 μL血浆,因此作者假设使用更大的血浆体积将通过增加存在的分析物分子数量来提高ORF1p的可检测性。通过使用提高20倍的样本量(500 μL血浆)和MOSAIC平台,我们的分析灵敏度提高了10倍,检测限为0.002 pg/mL ORF1p (17 aM三聚体)。


MOSAIC技术平台我们在之前的文章中也有提到:

2022年David R Walt在《ACS Nano》上发表的文章,讲述了一种新的单分子免疫检测方法MOSAIC,一种更灵敏、更精简的数字ELISA平台,即分子珠上信号扩增个体计数(Molecular On-bead Signal Amplification for Individual Counting, MOSAIC),该平台的检测原子摩尔下限较低,灵敏度比其他方法提高了一个数量级。MOSAIC为稀有目标分子提供了高采样效率,分析珠数可以很容易地调整,以提高高测量精度的信号到背景。此外,与基于微孔或液滴的数字方法相比,基于溶液的MOSAIC信号读出扩展了可同时测量的分析物数量,以飞摩尔或更低的灵敏度进行多重检测。


  杭州乐为生医科技有限公司



推出寡核苷酸纯化试剂盒,本试剂盒使用特殊的吸附膜和Bingding buffer,能够高效的将寡核苷酸片段结合到吸附柱上,适用于≥15nt-2kb片段的DNA的纯化回收,将寡核苷酸洗涤并浓缩到少量水(≥10 μl)中。纯化的寡核苷酸步骤简单,纯化后的寡核苷酸适用于抗体偶联、杂交,凝胶移位分析,酶促反应,连接,测序,微阵列分析等。吸附柱的结合DNA的量可达到10ug单链DNA或5ug双链DNA,回收率在85%以上。产品应用范围广泛,如同位素和染料去除-在体外标记反应后纯化,寡核苷酸荧光标记实验中有效地去除DNA中未掺入的荧光(如FITC, DIG, Cy3, Cy5, FAM等);酶促反应中的DNA片段清除;DNA进行脱盐等。


全国销售电话:19957893538,微信同号

技术支持电话:18611591243,微信同号


公众号已建立免疫PCR技术交流群,扫下方二维码+小编微信后邀请入群(验证通过请报备信息:姓名、工作单位,职务)。关于免疫PCR技术研究的问题,大家可以随时群内沟通,共同进步。



声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部