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罗氏收购纳米孔测序公司的测序原理分析

2024-5-27 17:08| 编辑: 归去来兮| 查看: 279| 评论: 0|来源: IVD精英者

摘要: “边扩大边测序”(SBX™ )技术是由 Stratos Genomics所开发的


结合技术原理分析,再去阅读推送的第四篇文章(纳米孔测序专题),综合市场背景等信息,应该会有深层次理解。

作者寄语


01

Stratos Genomics


“边扩大边测序”(“Sequencing By Expansion™”,SBX™ )技术是由 Stratos Genomics所开发的,此技术的关键在于一种被称作 X-NTPs 的新核苷酸。相较普通的 dNTPs,X-NTPs 在碱基环与五碳糖连接的磷酸基团之间增添了一个 loop,这个 loop 能够对 ATCG 这四种不同的核苷酸分别进行标记,并且在五碳糖和相邻的磷酸基团之间存在一个可切割的 linker。在切断 linker 后展开的 loop 长度是原本 DNA 长度的 50 倍,这样一来通过纳米孔时产生的信号得以放大,每个碱基的信号也更便于检测,同时相邻碱基的信号也更易于区分。

XNTP structure的描述:XNTP是指含有修饰过的核苷三磷酸(nucleoside triphosphate),它们是合成Taq聚合酶标记序列(Taq polymerase synthesis)时所使用的基本单元。每一个XNTP都包括了一个能够携带特定功能团的标签,这个功能团可以在DNA测序或者选择性引物延伸反应中发挥作用,并且被整合到最终产物的脊柱结构中。以荧光标记dNTPs为例,这种修饰过的dNTP可以在DNA测序技术如Sanger测序中使用,其中不同碱基对应不同颜色的荧光标记,通过检测其发出的信号来确定DNA序列。

模板依赖的Xpandomer合成使用定制工程聚合酶来准确地结合可扩展的核苷酸。注意:为了简化下面的图形,已经排除了移位控制。

切割:一旦目标DNA序列被复制,每个XNTP中的不稳定连接体被切割以产生全长Xpandomer,扩展到原始DNA长度的50倍

测序:Xpandomer使用纳米孔测序仪直接实时测序。纳米孔测序依赖于每个报告基因通过蛋白质纳米孔时电阻抗的变化。当Xpandomer通过纳米孔易位时,四个碱基特异性报告蛋白编码中的每一个都会显示特征信号。


02

Genia Technologies


与 Oxford Nanopore(ONT)测序技术相同的是,Genia 测序仪的测序载片构建基于“跨膜纳米孔阵列”“专用集成电路”这两个关键要素。但 Genia 与 ONT 的不同之处在于,Genia 的每个纳米孔上都连接着一个特定的 DNA 聚合酶,例如 phi29 聚合酶。根据理论推测,这个聚合酶能够捕获一条待测的核酸分子,无论其为线型或环形,然后进行聚合反应。

在碱基信号“载体”的产生方式上,Genia 与 PacBio 表现出更高的相似性。两者都采用了“单分子边合成边测序”的核心技术路线。这意味着在测序过程中,随着 DNA 聚合酶的作用,单个碱基会被依次添加到正在合成的 DNA 链上。同时,产生的碱基信号会被相应的检测系统捕获和记录,从而实现对 DNA 序列的准确解读。

这种“单分子边合成边测序”的技术具有许多优势。首先,它能够实时监测测序过程,提供高分辨率的数据。其次,由于不需要进行 PCR 扩增等预处理步骤,减少了实验误差和偏差。此外,该技术还能够应用于长片段 DNA 的测序,对于研究基因组结构和复杂基因调控等领域具有重要意义。

总的来说,Genia 测序仪通过独特的设计和技术创新,在碱基信号“载体”的产生方式上与 PacBio 相似,都采用了“单分子边合成边测序”的核心技术路线。这使得 Genia 能够提供准确、高效的测序数据,为生命科学研究和临床应用带来了新的可能性。

Genia 聚合反应所采用的“核苷酸类似物”结构如图所示(这里仅为一种代表性结构示例,理论上“检测标记”还可连接在核苷酸的其他合适位置,如碱基、戊糖等)。

可以看出,该结构与 PacBio 的“γ-磷酸基团荧光标记”结构相似,均是将“检测标记”直接连接到聚磷酸基的末端。但不同的是,Genia 的“检测标记”不一定是“荧光基团”,而可以是任何在纳米孔中可被检测到的化学基团或分子,如乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、化学发光化合物甚至核苷酸等。

理论上,Genia 能够使用不同种类或同一种类不同单位数量的“检测标记”来对四种核苷酸类似物进行有效区分,比如用不同单位数量的乙二醇分别标记 A(16)、T(20)、C(24)、G(36)。

以上图示意的“核苷酸类似物”为原料进行聚合反应,那么 Genia 测序技术的“碱基信号采集过程”可参考图中“A→E”步骤,即在 DNA 聚合酶的催化作用下,引物链每完成一个碱基的延伸,就会对应释放一分子的“检测标记”,而“检测标记”会随电流穿过纳米孔,这个过程中产生的“穿孔电流变化”将被传感器捕获并记录。


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